CELL-污染与排除

细胞培养的污染和排除教学目的1、掌握微生物污染的途径2、掌握微生物污染对细胞的影响3、掌握细菌与霉菌的污染4、了解支原体污染和检测5、了解潜伏病毒的污染和检查6、了解细胞的交叉污染原因及排除方法污染的概念：培养环境中混入对细胞生存有害的成分（微生物、化学物）或造成细胞不纯的异物（非同种其它细胞）组织培养污染应包括以下几个方面：1、微生物：真菌、细菌、支原体和病毒2、化学物：影响细胞生存的非细胞所需的化学成分3、细胞：非同种的其它细胞第一节污染途径一.空气操作室与外界隔离不严或消毒不充分；净化工作台使用过久，滤板未定期更换或长久不更换，滤气受尘埃堵塞；春夏季南方地区多雨，空气湿度大，含菌量多。二.清洗消毒培养器皿和容器洗刷不净残留污物、培养用液灭菌不彻底等三.操作器材和溶液使用前未仔细检查是否污染过；吸管、刀、剪沾染微生物；瓶口封不严；培养两种以上细胞，使用同一吸管或营养液。四.血清被支原体和病毒污染。五.组织手术中污染；组织本身带菌；用碘酒后擦拭不净造成碘污染。第二节污染对细胞的影响增殖缓慢、分裂相减少、粗糙、轮廓增强。停止增殖，分裂相消失，胞质中出现大量堆积物，变圆或崩溃从瓶壁脱落。污染物不同，对细胞的影响不同。一、污染的种类（一）真菌污染真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在霉雨季节进行细胞培养更易污染。培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形态，散在于细胞周边和细胞之间生长。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。真菌污染培养液变黄，混浊；48h以内很明显;细胞很快崩解死亡。镜下可见菌体。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。（二）细菌污染细菌污染（三）支原体污染支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2μm，可通过滤器。多数成球形，没有细胞壁，不能维持固定形态而呈现多形性。多吸附于细胞表面或散在细胞之间；在偏碱性条件下生存，对热敏感，对青霉素有抗药性；支原体电镜照片部分敏感细胞增殖缓慢、部分细胞变圆、从瓶壁脱落。多数无明显变化，或有微细变化却因传代或换液而缓解，不易发现。需精氨酸型支原体能急速消耗培养中的精氨酸，导致细胞变形；影响DNA合成，引起一系列严重后果，如改变细胞染色体核型、增加染色体畸变；与细胞竞争尿嘧啶，影响RNA的合成;能抑制细胞合成干扰素，降低细胞抵抗力；抑制细胞生长，降低细胞融合率。污染对细胞对细胞的影响一般说来，微生物污染具有以下特点：1)pH值突然改变：细菌污染pH值大都降低、酵母污染pH值很少改变，只有污染很严重时才会改变，真菌污染pH值会上升。如果48h内,pH值急剧变化，应考虑细菌污染的可能。2)培养基出现云雾状，有时在表面一片薄层云雾或泡沫，或细胞表面长出点状物，当移动培养瓶时消失。3)如怀疑支原体污染，可用Hoechst染色，荧光显微镜观察。二、细胞交叉污染对细胞的影响由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，操作不当，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。这种污染能使细胞的生长特性、形态特征等发生变化，有些变化较轻微、不易察觉，有些则可能由于污染的细胞具有生长优势最终压过原来细胞而导致细胞的生长抑制，最终死亡。常用观察细胞形态、分析生长特性和核型、检测细胞的标记物等方法检测交叉污染的细胞。第三节污染的预防和排除一、污染的预防1.器皿准备中的预防用于细胞培养的器皿应严格清洗，做到真正洁净；应该无菌的物品，要做到消毒严格，真正无菌；器皿在运输、贮藏过程中，要严格操作，谨防污染。①检查及定期清洗超净工作台滤网；②检查培养器皿是否有消毒标志，尽量使用一次性无菌器皿；③确保新配制的培养液无菌；④操作前提前半小时启动超净工作台及紫外消毒灯；⑤操作者应消毒双手和戴口罩。2.开始操作前的预防3.操作过程中的预防①不宜过早开瓶；开瓶后瓶口不能与风向相逆，保持斜立，不再使用的培养液应立即封闭瓶口,不允许触及器皿的无菌部分（瓶口及瓶塞内侧）；②开启及关闭瓶口时注意火焰烧灼及火焰附近工作；③应专管专用；④培养的细胞勿过早暴露于空气中；⑤操作时不准交谈、咳嗽；⑥操作完毕应整理好工作台面，并消毒擦拭工作面，关闭超净工作台。4.其他方面的预防①应及早冻存有价值的培养物②购入的未灭活血清应采取56℃水浴灭活30分钟③定期更换培养系统中的抗生素，或尽可能不用抗生素；④对新引进的细胞株应加强观察，防止外来的污染源；⑤定期清洁消毒CO2培养箱。二、污染的排除1．抗生素排除法加入5～10倍于常用量的抗生素后作用24～48小时，再换入常规培养液。抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。2.加温除菌将受支原体污染的细胞置于41℃中作用5～10小时(最长可达18小时)以杀灭支原体。但对细胞有不良影响，需预试验。3.动物体内接种接种在同种动物皮下或腹腔，借助动物体内的免疫系统消灭污染的微生物，待一定时间后，取出再培养繁殖，如肿瘤细胞。4.与巨噬细胞共培养吞噬微生物并将其消化。思考题1.污染的概念2.污染的途径主要有哪些3.在细胞培养过程中如何预防污染4.污染排除的方法