食品卫生微生物学检验-2.

食品卫生微生物学检验二菌落总数测定之一：检样稀释及培养。大肠菌群测定之一：检样稀释和乳糖发酵试验。实验流程：检样制成十倍、百倍和千倍稀释液。各取1ml稀释液分别加入2个灭菌平皿内和3支10ml乳糖胆盐发酵管中。平皿注入46℃营养琼脂约15ml→立即转动培养皿，充分混合均匀→静置→待琼脂凝固→翻转平板培养。菌落总数的检验程序检样↓做成几个适当倍数的稀释液↓选择2个～3个适宜稀释度各取1ml分别加入灭菌培养皿内↓每皿内加入适量营养琼36℃±1℃↓48h±2h菌落计数↓报告大肠菌群检验程序检样↓稀释↓乳糖胆盐发酵管,36℃±1℃，24h±2h↓↓不产气产气↓↓大肠菌群阴性伊红美蓝琼脂平板,36℃±1℃，24h±2h↓↓↓报告革兰染色乳糖发酵管,36℃±1℃，24h±2h↓↓↓↓革兰阳性革兰阴性无芽胞杆菌产气不产气↓↓↓↓大肠菌群阴性大肠菌群阳性大肠菌群阴性↓↓↓报告报告报告菌落总数依据检验规范中检验菌落总数的条件,不能检测出检样中实际的活菌数。因为厌氧菌、微需氧菌、嗜冷或嗜热菌以及有特殊营养要求的细菌,在此条件下不能生长或不能很好地生长。用目前检验规范方法所获得的结果,只包括一群能在营养琼脂培养基上生长发育的嗜中温的需氧或兼性厌氧的细菌菌落总数,它必然低于实际存在的活菌数。菌落总数是用来判定检样被细菌污染程度的指示菌。不能表明污染菌的种类和来源。检测菌落总数注意事项做菌落总数检验时应接种一空白平皿作对照,以检验培养基、器皿和稀释液的灭菌效果。吸管进出瓶子或试管时，吸管口不得触及瓶口、管口的外围部分。作样品稀释时,应小心沿管壁加入,不要触及管内稀释液,以防吸管尖端外侧部分粘附的检液混入其中。为防止产生片状菌落,在检样加入平皿后,应于20min内向皿内倾入营养琼脂培养基,并立即混合均匀。皿内琼脂完全凝固后,不要长久放置才翻转培养,而应于琼脂完全凝固后,在数分钟内将平皿翻转进行培养,这样可避免菌落蔓延生长。大肠菌群检验大肠菌群通常用定量方法,只有在标准中规定不得检出时用定性方法,常用的定性检验方法为多管发酵法。多管发酵法是检验检样中大肠菌群公认的传统方法,其结果以最大可能数量(MostProbableNumberMPN)来表示。它是根据概率公式得来,用来估计样本中大肠菌群的密度。根据接种量和管数的不同,以100ml样品中所含的大肠菌群细菌的最可能数作出报告。稀释度的选择:对低污染水样,选择10ml,1ml和0.1ml3个稀释度;如果污染较重,相应稀释度就应大些,如1ml,0.1ml和0.01ml或更大。在无法估计其细菌污染量时,可多做几个稀释度,待结果出来后,可根据MPN表酌情选择。单号组分别检测1号标本“屠宰场井水”。双号组分别检测2号标本“奶茶或豆浆”。分别按P10“菌落总数测定”的检样稀释及培养和P16“大肠菌群测定”的检样稀释和乳糖发酵试验的方法进行操作。注意稀释一份检样，分别做两个实验。标本混合均匀。使用无菌器材。严格无菌操作。★在操作之前，先作标记。在平皿底部，225ml生理盐水瓶、中试管和10ml乳糖胆盐发酵管的上2/3作标记。例如1-1-1表示第1组，1号标本，10倍稀释。10-2-3表示第10组，2号标本，1000倍稀释。1.先用10ml刻度吸管分别（从100ml盐水瓶中）吸取盐水9ml加入中试管内，每组2支，用来做百倍和千倍稀释。2.用10ml刻度吸管，吸取检样25ml，加入225ml生理盐水中，充分振摇，制成1:10的均匀稀释液。3.用1ml刻度吸管分别吸取1:10稀释液1ml,注入2个直径9厘米无菌的空平皿内，3支10ml乳糖胆盐发酵管和一支标有百倍稀释的生理盐水管中(注意：沿管壁徐徐注入,吸管尖端不要触及管内稀释液，下同），将百倍稀释的生理盐水管漩涡震荡混合均匀。4.换另一支1ml刻度吸管，按上述方法，分别吸取混合均匀的百倍稀释液1ml,注入2个平皿、3支乳糖胆盐发酵管和1支标有千倍稀释的生理盐水管中。5.如此，依次作十倍、百倍、千倍的稀释和加样。6.在含有1ml标本的9cm平皿中（待七个平皿均加样后再操作），注入约15ml培养基，立即摇动平皿，右三圈，左三圈，右三圈，让培养基旋转流动、充分混合均匀。静止放置20～30分钟，待琼脂完全凝固。倒置平板，培养36℃48小时，观察结果。※130ml营养培养基加热溶解，待温度降到50～60℃，放47℃恒温水浴箱中平衡温度。※225ml生理盐水用于10倍稀释，9ml生理盐水用于百倍和千倍稀释。25ml1ml1ml225ml生理盐水稀释倍数：10－110－210－3菌落数：多不可计16420164×102＝1.64×104CFU/ml待测样品15ml培养基9ml生理盐水1ml↓2个1ml↓2个1ml↓2个待测样品225ml生理盐水10ml乳糖胆盐发酵管25ml1ml1ml稀释倍数：10-110－210－31ml↓3支1ml↓3支1ml↓3支9ml生理盐水刻度吸管的无菌操作方法吸球的选择：无菌操作时，一般不使用洗耳球。5毫升和10毫升刻度吸管用洗牙球，1毫升刻度吸管套用合适的小吸球。无菌操作方法：左手手指捏住吸管头包装纸套约5厘米处，右手向前旋松纸套、撕断包装纸头，如果吸管头部外测有棉花絮，应该烧掉，然后套上吸球，以免连接部位漏气。此时，包装纸套出口处已经污染。应把包装纸反向拉开，折出一个无菌倾斜出口，退出吸管，管尖呈30～40度角离开无菌包装纸套。吸球的按压程度，以按压松开以后，能吸取110％的液体为宜。这个按压程度，很容易控制吸管中液体，移液过程中，也不会因为失控，对吸球过度加压或减压，液体就不会外流，空气也不容易进入吸管内，这样可以把污染降到最低程度。思考题食品中微生物为何繁殖迅速、种类繁多？食品被微生物污染后有哪些危害？检样稀释时，每个稀释度都要更换刻度吸管，为什么？常用器材摆放顺序：电源插座→试管架→酒精灯→污物盘。试管架上器材：靠近插座一侧第1和第2列分别放置接种针和接种环，另一侧中间两行放置油性笔和打火机。※器材使用后，必须放回原处，依次摆整齐。实验室器材整齐有序