(完整)HIV-P24蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备-8.24修改

HIV-1P24蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备汪龚泽，刘朝奇，杨建林，覃晓琳，吕佰瑞，姚佳红三峡大学分子生物学研究所，湖北宜昌443002摘要：目的：制备HIV-1P24蛋白及单克隆抗体，建立ELISA方法用于检测HIV感染。方法：用PCR方法扩增P24基因，将其克隆到原核表达载体PET-28a（+）中,经大肠杆菌表达并纯化HIV-1P24蛋白。以纯化的P24蛋白抗原免疫Balb/c小鼠，取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合,制备能产生P24.单克隆抗体的杂交瘤细胞株,进一步采用Westernblotting、ELISA等技术对制备的单克隆抗体进行初步鉴定，建立了P24的ELISA竞争法。结果：原核表达重组质粒在大肠杆菌中能高效表达P24蛋白,并进一步从杂交瘤细胞中选取了能稳定分泌P24单抗的杂交瘤细胞株。应用ELISA竞争法测定的HIV-1阳性病人血浆P24与病毒载量显著相关。结论：成功制备了P24蛋白及特异性单克隆抗体，建立了P24的ELISA竞争法。关键字：HIV-1P24，原核表达，单克隆抗体，ELISAExpressionofHIV-1P24proteinandPreparationofitsmonoclonalantibodiesWANGGONGZE,LIUCHAOQI,YANGJIANLIN,QINGXIAOLIN,LVBAIRUIInstituteofMolecularBiology;ThreeGorgesUniversity;YichangHUBEI443002;ChinaABSTRACT:ObjectiveToconstructProkaryoticexpressionplasmidofHIV-1P24,purifyrecombinantHIV-1P24proteinandprepareitsmonoclonalantibodies.MethodsHIV-1P24cDNAwasclonedintoprokaryoticexpressionvectorpET28a(+)andwasfurthertransformedintoE.coliBL21(DE3).TherecombinantHIV-1P24proteinwasusedtoimmunizeBalb/cfemalemouse.ThesplenocyteswerefusedwithSP2/0hybridomatoproducemonoclonalantibodyagainstHIV-1p24protein.WesternblottingandELISAwerecarriedouttoidentifythemonoclonalantibodyproducedbythesehybridomas.ResultsHIV-1P24plasmidwassuccessfullyconstructedandidentifiedbyenzymedigestionandsequencing.HIV-1P24proteinwasexpressedintheE.coliBL21(DE3)andpurifiedbyaffinitychromatography.AftertheimmunizedmurinesplenocyteswerefusedwithSP2/0hybridoma,weselectedhybridomacelllineswhichwereabletoproducemonoclonalantibodiesagainstHIV-1P24stablely.CompetitionELISAassaywasestablishedandthep24proteinofHIV-1positiveplasmawassignificantcorrelatedwiththeHIV-1viralload.ConclusionsWesuccessfullyexpressedHIV-1p24andpreparehybridomaswhichcanstablelyproducemonoclonalantibodiesagainstHIV-1P24.KEYWORDS:HIV-1P24;prokaryoticexpression;monoclonalantibody;ELISAHIV是艾滋病的病原体，主要通过性接触、血液和母婴传播。近年来，HIV感染患者数量一直呈上升趋势。根据卫生部统计，中国自1985年发现第一例艾滋病病人以来，截至2009年10月底，累计报告艾滋病病毒感染者和病人319877例。2009年当年新发艾滋病病毒感染者4.8万人，我国艾滋病疫情形势依然严峻，性传播正在成为主要传播途径[1]。而目前测定血清HIV抗体是诊断HIV感染的常规实验方法,但是测定HIV抗体有局限性:有超过70%的HIV感染者在感染6个月后才能检测出抗体,在同性恋群体,这个数字超过80%,检测抗体方法增加了HIV“窗口期”传播的危险[2];另外新生儿产生抗体需要出生1年后,来自母亲的HIV抗体会致使假阳性产生;由于HIV抗体在疾病过程中持续存在,只是到艾滋病晚期时消失,无法作为治疗监测的稳定指标[3]。P24是HIV病毒颗粒的主要结构蛋白,是结构基因gag的产物，在病毒的包装和成熟过程中起重要作用[4]。P24蛋白的氨基酸序列在HIV各毒株之间高度保守,缺失P24会导致病毒无法正常组装。P24蛋白特异性很强,与多数其他逆转录病毒无交叉反应。HIV感染人体，感染者血液中首先出现的病毒标志物为病毒P24蛋白，从病毒感染到检出抗HIV抗体之间存在较长的窗口期，因此检测HIV-1P24抗原已在HIV感染的早期诊断、患者的预后判断、筛选和评价抗HIV的药物,以及发现母-婴传播等方面发挥了重要作用[5][6]。且大量科学家不断探索和建立提高HIVP24抗原敏感性的方法，DosRamosFarias等[7]对婴儿的血浆样品离心后再进行检测，导致P24抗原检测的敏感性显著增加。瑞士国家逆转录病毒中心（SNCR）报道了一种缓冲液，在检测过程中使用该缓冲液可以提高P24抗原的检测能力[8]本课题组由此克隆表达p24蛋白，并获得p24的单克隆抗体细胞株并进行了临床样本检测，为检测HIV感染提供实验基础。1材料和方法1.1材料实验所需限制性内切酶、T4连接酶及TaqDNA聚合酶均购自Fermentas公司。菌株E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)、质粒pET28a(+)和HIV-1HBX2重组质粒由本研究所保存。鼠源的抗HIS标签抗体，HRP标记的羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Balb/c小鼠购自湖北省实验动物中心。RPMI-1640、次黄嘌呤(H)、胸腺嘧啶(T)、HEPES、ABTS、MBS购自Sigma;氨基蝶呤(A)、PEG(MW1500)购自Fluka。SP2/0细胞本研究所保存。1.2方法1.2.1pET28a(+)-p24基因重组质粒的构建以HIV-1HBX2基因为模板,PCR方法扩增P24基因。设计引物为：5´-CAGGATCCCTATAGTGCAGAACATCCAGG-3´;5´-CGACTCGAGCAAAACTCTTGCCTTATGG-3´,其引物中分别引入酶切位点BamHI/XhoI。原核表达载体PET28a(+)用BamHI/XhoI双酶切将其线性化后,与P24段目的基因的酶切产物于16℃连接过夜。5μl连接产物转入大肠杆菌DH5a中,接种LB卡那霉素抗性固体培养基37℃培养过夜,挑取单克隆至1.5ml卡那霉素LB培养基中37℃,220r/min培养过夜,次日提取质粒用于酶切和测序鉴定。1.2.2pET28a(+)-P24基因原核表达与鉴定将构建好的重组质粒pET28a(+)-P24转化到宿主菌BL21(DE3)中,经IPTG(终浓度1.0mmol/L)诱导表达,收集的细菌加入等体积2×SDS凝胶上样缓冲液,100℃煮沸3min,冰浴4min,室温下离心(12000r/min)1min,取20μl进行SDS-PAGE电泳[9]。考马斯亮蓝染色,通过凝胶成像系统测定表达产量。Westernblot检测重组pET28a(+)-P24蛋白,SDS-PAGE电泳后转移硝酸纤维素膜,用5%脱脂奶粉封闭;加抗HIS标签单克隆抗体(1∶500)室温轻摇作用2h;TBST洗涤3次,每次5min;加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶2000)室温反应2h,同上洗涤;ECL显色。1.2.3PET28a(+)-P24蛋白的纯化质粒PET28a(+)-P24阳性菌BL21(DE3)经IPTG诱导表达,5000r/min离心收集菌体,将细菌重悬于BufferA中(0.5mol/LNaC,l20mmol/LTris-HC,lpH8.0)4℃条件下超声波破碎细菌,离心洗涤包涵体,8mol/L尿素变性增溶后经Ni-NTAagarose亲和柱分离纯化目的蛋白。纯化蛋白使用透析方法复性,尿素浓度梯度依次为6mol/L、4mol/L、2mol/L、1mol/L、0.25mol/L、0.1mol/L、0mol/L,每个浓度透析时间为12h。1.2.4制备p24单克隆抗体以50μgP24蛋白抗原与弗氏完全佐剂混合制成乳剂,经皮内多点注射进行免疫。1个月后,用相同剂量的抗原加弗氏不完全佐剂经尾静脉进行加强免疫共3次,每次间隔2周。经免疫后小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞以50%PEG促融。培养至第10d，以间接ELISA法筛选阳性孔,有限稀释法克隆化3次至克隆生长孔100%阳性，克隆化后的细胞株经传代确定为稳定的细胞株后，液氮保存。Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡(0.5ml/鼠),10d后腹腔注射杂交瘤细胞1×106个/鼠制备腹水。取腹水mAb经饱和硫酸铵分级沉淀后,用ddH2O溶解收集加等量的无菌丙三醇-20℃保存。1.2.5Westernblotting鉴定P24单克隆抗体及ELISA法测定抗体效价Westernblotting鉴定P24单克隆抗体：取P24蛋白及阴性和阳性对照蛋白，进行SDS-PAGE电泳，转移硝酸纤维素膜,制备成抗原条带。用5%脱脂奶粉封闭，分别以HIS标签抗体或p24单克隆抗体或正常鼠血清为一抗(1∶500)室温轻摇作用2h;TBST洗涤3次,每次5min;加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶2000)室温反应2h,同上洗涤;ECL显色。ELISA法测定抗体效价：使用碳酸盐缓冲液包被P24抗原（浓度为1ug/ml、每孔100ul）4℃包被16小时，使用PBST洗涤液洗涤ELISA板三次，1%BSA37℃封闭1小时。在每条ELISA板分别以1/100、1/500、1/2500、1/12500、1/62500、1/312500、1/162500的稀释抗体作为一抗加入ELISA板，其中以PBST代替P24单克隆抗体作为阴性对照。37℃孵育一小时后，使用PBST洗涤液洗涤ELISA板三次，并在洗涤后加入HRP标记的羊抗鼠IgG（1：2000）作为二抗，37℃孵育一小时后，同样洗涤，TMB显色，2MH2SO4终止反应，在450nm波长测定吸光度值。1.2.6ELISA法检测艾滋病病人血浆P24含量标准曲线制备：应用竞争抑制ELISA方法，使用碳酸盐缓冲液包被P24抗原（浓度为1ug/ml、每孔100ul），1%BSA37℃封闭1小时。然后每孔加入一抗为1：200倍稀释的P24单克隆抗体和不同浓度的P24蛋白37℃孵育一小时，其中阴性对照为不加P24单克隆抗体，阳性对照为不加P24蛋白。洗涤后加入HRP标记的羊抗鼠IgG（1：2000），37℃孵育一小时后，同样洗涤，TMB显色，测定吸光度值，绘制标准曲线。以P24蛋白为抗原包被，包被浓度同上，使用0.5%Tritonx-100将HIV-1阳性的血浆样本处理，50倍稀释后，与1：200倍稀释的P24单克隆抗等体积混合37℃孵育一小时，使用PBST洗涤液洗涤三次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG（1：2000）37℃孵育一小时，洗涤，TMB显色，测