烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生

烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生时光（200113813）刘超（200113821）（01生物技术(2)班）摘要:植物组织培养是指在无菌的条件下，分离并在培养基中培养离体植物组织、器官或细胞的技术[1]。包括：器官培养，花药和花粉培养，组织培养，胚胎培养细胞培养，原生质体培养。其培养基是由无机营养物、碳源、维生素、生长调节剂和有机附加物等五类物质。激素是植物组织培养的关键因素,离体培养物的根芽分化取决于生长素/细胞分裂素的比值。另外，光照还影响到愈伤组织细胞之间的结合的紧密度和愈伤组织的色泽，以及再生植株的颜色,对芽的分化有显著性的影响。（摘要应概括论文试验主要结果）关键词:烟草，愈伤组织，诱导，植株再生1．前言细胞是生物体的结构单位和功能单位。细胞工程就是利用细胞的全能性，采用组织与细胞培养技术对动、植物进行修饰，为人类提供优良品种、产品和保存珍贵物种[2]。细胞工程主要包括体细胞融合，核移植，细胞器摄取和染色体片段的重组等。植物组织培养是植物细胞工程中研究得比较早、也比较成熟的技术。试管苗的快速繁殖、无病毒植物的培育等研究成果已经处在应用、推广阶段[3]。离体的植物器官、组织或细胞，在培养了一段时间以后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织。愈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化，或者叫做去分化。脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化[4]。再分化形成的试管苗，移栽到地里，可以发育成完整的植物体。植物组织培养的过程可以简要归纳为：影响植物细胞脱分化产生愈伤组织的一个重要因素是植物激素。当细胞分裂素与生长素共同使用时，能强烈地刺激愈伤组织的形成。植物激素还会影响到再分化过程中芽和根的发生。早在20世纪50年代初，我国植物生理学家崔徵等人就发现细胞分裂素与生长素之间的浓度比，可以调控植物组织培养过程中芽和根的形成[5]。当细胞分裂素与生长素的浓度比高时，有利于芽的发生；当浓度比低时，则有利于根的发生。植物细胞只有脱离了植物体，在一定的外部因素作用下，经过细胞分裂形成愈伤组织，才表现出全能性，由愈伤组织细胞发育、分化出新的植物体[6]。植物组织培养技术的应用范围是很广的，除了必修课中介绍过的快速繁殖、培育无病毒植物外，还可以通过大规模的植物细胞培养来生产药物、食品添加剂、香料、色素和杀虫剂等。例如，从大量培养的紫草愈伤组织中提取的紫草素，是制1造治疗烫伤和割伤的药物以及染料和化妆品的原料。用植物组织培养的方法，诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力的胚状结构，包裹上人造种皮，制成人工种子，可以解决有些作物品种繁殖能力差、结子困难或发芽率低等问题。此外，转基因植物的培育，也要用到植物组织培养的方法[7]。本次实验得目的就在于掌握无菌超作技术;基本掌握职务愈伤组织诱导培养技术和调控条件;同时观察和分析不同光照条件形成的愈伤组织对器官分化的影响,观察和分析愈伤诱导和器官分化的激素使用差异。了解器官分化和植株再生的过程。2．材料与方法2．1材料与仪器实验材料：烟草无菌苗、烟草叶片愈伤组织主要实验仪器：培养皿、超净工作台、不锈钢镊子、剪刀、解剖刀、酒精灯、75％酒精、MS培养基等。2．2实验方法2．2．1培养基的配制首先配制MS培养基母液（MS培养基配方见《植物生理学》第二版，潘瑞炽、董愚得，高等教育出版社，1995，第250页），然后在其基础上加入BA,NAA,Sucrose，Agar，再在容量瓶中加入除蔗糖和琼脂以外的其他成分，然后加入所需体积的约2/3~3/4的蒸馏水，搅拌均匀后，加入蔗糖后搅拌使其溶化，用0.5N的NaOH和0.5N的HCL调整pH至5.8～6.0。然后加入琼脂并加热搅拌使其溶化，最后用蒸馏水定容并分装，灭菌冷却后备用。即可得实验所需的愈伤组织诱导培养基。2．2．2愈伤组织诱导把消毒好的烟草无菌苗叶片在无菌的情况下切成小块并放入培养基。接种时一定要严格做到无菌操作,首先再自来水下将手洗净，然后用75％酒精消毒，超作在超净工作台中进行。每个三角瓶内接3—5片无菌叶片（叶片大小约2mm²左右），分别于光照下，和黑暗的条件下24ºC诱导愈伤组织，直到愈伤组织完全形成。（注意：所用的镊子，解剖刀灯要用酒精消毒并在酒精灯下烤干；外植体切割时，动作要快，否则会造成外植体失水而影响生长。为防止超作时失水液可在培养皿中滴几滴无菌水，然后将无菌苗置于其中进行切割。接种完毕记录培养基的凝固状态，操作过程，叶片生长状况，外植体大小，每瓶接种数，接种总瓶数。）植物已经分化的细胞在切割损伤或在适宜的培养基上可以诱导形成失去分化状态的结构均一的愈伤组织或细胞团。外植体一旦接触到诱导培养基，几天后细胞就出现DNA的复制，迅速进入细胞分裂期。3—7天开始形成愈伤组织。[8]2．2．3植株分化将诱导的愈伤组织，按类型分别转入分化培养基上（分化培养基的配制：MS培养基附加2.0mglBA、0.5mglNAA。），置于连续光照，20—22ºC条件下培养。要及时观察分化情况。需要注意的是，愈伤组织的诱导常常受很多因素的影响，如果转入分化培养基后3－4周仍然没有芽的形成，或愈伤组织状态没有变化，应及时调整培养基浓度，更换新鲜培养基。记载上次实验愈伤组织诱导结果：愈伤组织诱导率，愈伤组织大小，状态，不同光照形成的愈伤组织状态描述，污染率统计。以及本次实验超作过程，接种瓶数，每瓶接种量。23.结果分析（还需针对表中的数据进行分析）3．1愈伤组织诱导通过观察记录分析，在不同培养条件下即不同光照下愈伤组织的形成情况及生长状态（包括：颜色,大小，紧密度）等记录于表1。愈伤组织诱导率%=实际形成愈伤组织数/接种外植体数×100。表1.烟草叶片愈伤组织诱导情况统计表编号每瓶接种数培养条件(暗、光)愈伤组织个数愈伤组织诱导率(%)愈伤组织状态污染率(%)15光5100%翠绿色，结构紧密,清亮0%25光5100%翠绿色，结构很紧密0%35光360%翠绿色，结构紧密0%45光480%绿色，结构紧密0%55光360%绿色，结构较紧密0%65光5100%绿色，结构紧密0%75暗5100%黄色，结构疏松0%85暗480%黄色，结构疏松,表面多皱褶0%95暗480%黄色，结构疏松,块较小0%105暗5100%黄色，结构疏松,色黯淡0%115暗5100%黄色，结构疏松,大小较均一0%125暗480%黄色，结构疏松0%3.2器官分化与植株再生表2统计了不同来源的愈伤组织芽的分化情况及分化状态（分化率%=能够分化芽的愈伤组织/接种愈伤组织×100）。3表2.烟草愈伤组织再生植株情况统计表编号愈伤组织来源（暗、光）分化率（%）每个愈伤组织分化芽数分化芽状态污染率（%）1光100%272光100%253光80%184光100%435光100%246光80%49生长良好,叶片颜色深绿,芽数量多,簇拥在愈伤组织上0%0%0%0%0%0%7暗60%118暗80%89暗100%1510暗75%2711暗100%1312暗100%23生长较差,叶片颜色浅绿,有的淡黄,芽数量少,并不紧密0%0%0%0%0%0%3.3两种类型愈伤组织分化能力差异显著性分析3.3.1分化率的差异显著性分析:用生物统计学方法对以上实验数据结果进行显著性差异分析。假设不同条件对愈伤组织的形成没有显著性差异。4表3.不同条件对愈伤组织的形成影响的方差分析表来源平方和自由度均方F值临界值显著性处理间0.7510.75处理内5.5100.55总和6.25111.36F0.05=4.75F0.10=3.18由于F=1.36F0.05=4.75,因此在α=0.05的显著性水平下，原假设成立，在本实验中，可以认为光照的条件对愈伤组织的形成没有影响。3.3.2芽分化数的差异显著性分析:假设不同条件对愈伤组织再生形成芽没有显著性差异。表4.不同条件对愈伤组织再生形成芽的影响的方差分析表来源平方和自由度均方F值临界值显著性处理间660.081660.08处理内1006.8410100.684总和1666.92116.56F0.05=4.75F0.10=3.18**由于F=6.56F0.05=4.75,因此在α=0.05的显著性水平下,原假设不成立，因此认为光照对芽的分化有极显著性的影响。在烟草叶片组织培养中，植物激素是离体培养中所必需的条件，也是众多影响因素中起着关键作用的。离体培养下的器官分化在大多数情况下是通过外源提供适宜的植物激素而实现的，外源激素对组织培养和器官的分化的调节可能是通过影响内源激素的水平来实现的[9]，而且形成器官的类型是由培养基中不同激素的相对浓度控制的，生长素/细胞分裂素高，则有利于根的分化；反之，则有利于芽分化。因此，生长素与细胞分裂素必须协调使用才能再生正常个体。光照对愈伤组织的诱导没有显著性的影响，但是可能对愈伤组织的状态有一定的影响，因为通过观察，光照条件下的愈伤组织较暗条件下的愈伤组织色泽明亮，结构更为紧密。而光照对芽的分化有显著影响，它是离体培养中比较复杂的因子，光照时间、强度以及光质对器官分化均有影响[10]。4．小结据实验结果及分析可知，光照对愈伤组织的诱导没有显著性影响，但可能对愈伤组织状态有一定影响；光照对芽的分化有极显著性影响，培养条件下，光照的作用更大程度上是调节细胞的分化状态，而不是合成光合产物，而光照对器官发生的调节可能与调节培养物的内源激素平衡有关，光照还可能影响生长素的信号传导系统，调整生长素的极性运输，从而引起器官分化。对此，我们5的思考是：光照条件下诱导的愈伤组织状态较暗条件下好，而其芽的分化数量也显著比暗条件下多，由此推断愈伤组织的状态可能和芽的诱导率有一定的关系。参考文献：[1]许智宏、刘桂云，烟草叶组织培养中愈伤组织和芽形成的细胞学观察，1980：植物学报，22[2]王联结主编生物工程概论2002年03月第一版89[3]李世润、张举仁等，玉米胚性愈伤组织的诱导及植株再生的研究，1990:山东大学学报，25:116-124[4]王煜、杨雨晗等，烟草叶细胞植株再生的研究，2002：四川大学学报，39[5]焦浈，秦广雍等，烟草叶片愈伤组织诱导及真空耐受性研究，2003：郑州大学学报，35[6]曾虹燕，周朴华，元宝草愈伤组织诱导和器官分化，2002：植物生理学通讯，38[7]周种泽、曹蘅，葶苈子植物愈伤组织诱导及植株再生的研究，2001：安徽大学学报，25[8]TsaiChi-kuci，ChienYing-chien，ChouYun-loandWuSu-hsuen,1977:RegenerationofPlantfromtobaccoprotoplastsandsomefactorsaffectingtheplantdifferentiation.ScientiaSinica,19:458-468[9]Bhat,S.R.,B.V.Ford-LloydandJ.A.Callow,1985:Isolationofprotoplastsandregenerationofcallusfromsuspensionculturesofcultivatedbeets.PlantcellRep,4:345-350[10]Bui-Dang-Ha,B.NorreelandA.Masset,1975:RegenerationofAsparagusoffcicinatisthroughcallusculturederivedfromprotoplastsT.Exp.Bot,26(90-92):263-270Inducementoftobaccocallusandregenerationoftheplant（ShiGuang，LiuChao）Abstract:Theplanttissuecultureisatechniqueundertheaseptictermpoint,separateandeducatesorganizes,organorcell