04组培养教案

11绪论植物组织培养是二十世纪发展起来的新技术，近三十年来由于组织培养基础理论研究的深入，发展极为迅速，发表文献浩如烟海，几乎以植物为研究对象的各个分支学科都在广泛进行组织培养。1902年，德国植物学家Haberlandt根据细胞学说，提出单个细胞的植物细胞全能性（totipotency）理论。→初步成功：1904年，Hanning最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚。→开始大量的实验研究，技术逐步完善→1960年“兰花工业”的巨大利润冲击→促使新一轮研究热潮的兴起→奠定了新兴独立的学科→植物组织培养学。目前达到的水平：从任何植物的器官、组织、细胞，甚至没有细胞壁的裸露原生质体中再生小植株。在这一技术的发展上，各国竞相投资，在快繁、脱毒、育种、次生代谢物生产、种质资源的保存方面取得了巨大的社会、经济、生态效益。第一章：植物组培的基本理论第一节：植物组培的概念一、概念：广义的定义：离体（invitro)条件下利用人工培养条件在无菌情况下培养、生长、发育再生出完整植株的过程。将离体的植物的器官、组织、细胞和原生质体培养在人工配置的培养基上，给予适当的培养条件，使细胞增殖或诱导长成完整的植株。根据外植体的来源的不同，又可以分为：组织培养按培养对象可分为植株、器官、组织、细胞培养和原生质体培养等：(1)、植株培养(plantculture)：是对完整植株材料的培养，如幼苗及较大植株培养。(2)、器官培养(organculture)：即离体器官的培养，根据作物和需要的不同，包括分离茎尖、茎段、根尖、叶片、叶原基、子叶、花瓣、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果实等外植体培养。(3)、组织或愈伤组织培养(tissue。rcallusculture)：为狭义的组织培养，是对植物体的各部分组织进行培养，如茎尖分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮组织、胚乳组织和薄壁组织等等；或对由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养，二者均2通过再分化诱导形成植株。(4)、细胞培养(cellculture)：是对由愈伤组织等进行液体振荡培养所得到的，能保持较好分散性的离体单细胞或花粉单细胞，或很小的细胞团的培养。(5)、原生质体培养(proplastculture)：用酶及物理方法除去细胞壁的原生质体的培养。根据培养条件的不同，又可分为：液体培养固体培养半固体培养光培养暗培养二、常用名词的解释：1、愈伤组织（callus）在人工培养基上由外植体上形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。器官发生→植株胚状体发生→人工种在子、转基因材料外植体→愈伤组织→悬浮细胞培养→次生代谢物的培养原生质体培养→细胞融合2、外植体（explant)：由活体（invivo)植物体上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。几十年来，人们广泛尝试使用不同的材料作外植体，如Haberlandt用叶肉细胞、髓细胞、腺毛、雄蕊毛、气孔保卫细胞。由于对细胞性质和条件摸索的不够，均未成功。基本上要用薄壁组织，而成熟组织如机械组织、输导组织、分泌组织不易成功（如山西农科院用果柄）。复习组织的类型）第二节：植物组织培养的理论基础一、植物细胞的全能性植物细胞的全能性（totipotent)：植物细胞具有该植物体全部遗传的可能性，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。3原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。差异：（1）受精卵的全能性最高（2）受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。潜在全能性的原因：基因表达的选择性。科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。二、植物细胞全能性的表达分化：脱分化（dedifferentiation）：将来自已分化组织的已停止分裂的细胞从植物体部分的抑制性影响下解脱出来，恢复细胞的分裂活性。再分化（redifferentiation）：经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可有转变为各种不同细胞类型的能力。三、外植体离体分化过程的类型：1、无菌短枝型：也称节培法或微型扦插法。将待繁殖的材料剪成带一叶的单芽茎段转入成苗培养基，一定时间后可成苗，再剪成带一叶的单芽茎段，继代又可成苗。特点：该方法一次成苗，遗传性稳定，培养过程简单，适用范围大，移栽容易成活。试管繁殖常用，也是其他方法最后阶段常用的方法，但初期繁殖速度慢。2、丛生芽增殖型：茎尖或初代培养的芽，在适宜的培养基上诱导，不断发生腋芽而成丛生芽，然后再转入生根培养基，诱导生根成苗，扩大繁殖。特点：这种方法从芽到芽，遗传性稳定，繁殖速度快，是茎尖培养和脱毒苗初期的必由之路。但过程复杂，品种差异大。3、由愈伤组织再分化，有下面两种方式：A．不定芽方式（unfixedbud）指愈伤组织培养物，通过形成不定芽再生成植株，这是细胞和组织培养中常见的器官发生方式。愈伤组织的器官发生顺序有四种情况：4（1）愈伤组织公有根或芽器官的分别形成，即无根的芽或无芽的根；（2）先形成芽，再在芽伸长后，在其茎的基部长出极而形成小植株，多数植物属这种情况；（3）先产生根，再从根的基部分化出芽而形成小植株。这种情况较难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物；（4）先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合形成一小植株。B．胚状体方式（somaticembryo）指由培养细胞诱导分化出的胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。（以后章节中介绍）4、原球茎型第三节：植物组培的特点一、培养条件可以人为控制组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。二、生长周期短，繁殖率高植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比较小，往往20—30d为一个周期。所以，虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。三、管理方便，利于工厂化生产和自动化控制植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，既利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫害等一系列繁杂劳动，可节省人力、物力及田间种植所需要土地。四、植物组织培养的材料经济取材少，培养效果好，对品种推广及复壮均有意义。非洲紫罗兰的一枚叶片，三个月可以得到5000株苗。52第二章：植物组培的发展和应用第一节：发展简史一、植物组织培养的探索阶段：1838-1839年，德国科学家Schleide和Schwann发表了细胞学说，奠定组织培养理论基础。1902年，德国植物学家Haberlandt根据细胞学说，提出单个细胞的植物细胞全能性（totipotency）理论。1904年，Hanning最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚。1922年，Knudson采用胚培养法获得大量兰花幼苗。1934年，White用番茄根尖建立起第一个活跃生长的无性繁殖系，从而使非胚器官的培养首先获得成功。二、植物组织培养的技术建立阶段：1933年李继侗培养了银杏离体胚，3mm大小的胚可培养成功，用胚乳、种子、果实提取物促使胚发育。1934年美国的White由番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，并反复转移到新鲜培养基中继代培养，使根的离体培养实验获得了真正的成功，并在以后28年间培养了1600代。这之后，White又以小麦根尖为材料，研究了光、温度、通气、pH值、培养基组成等各种培养条件对生长的影响，并于1937年建立了第一个组织培养的综合培养基，其成分均为已知化合物，包括3种B族维生素，即吡哆醇、硫胺素和烟酸，该培养基后来被定名为White培养基。Gautherer(1934)在研究山毛柳和黑杨等形成层的组织培养实验中，提出了B族维生素和生长素对组织培养的重要意义，并于1939年连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。同年，White由烟草种间杂种的瘤组织，Nobecourt由胡萝卜均建立了与上述类似的连续生长的组织培养物。因此，Gautherer，White和Nobecourt一起被誉为组织培养学科的奠基人。我们现在所用的培养方法和培养基，基本上都是由这三位科学家建立的。后来，White于1943年发表了《植物组织培养手册》专著，使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。40年代Skoog和崔徵在烟草茎切段和髓培养以及器官形成的研究中发现，腺嘌6呤或腺苷可以解除培养基中生长素(1AA)对芽形成的抑制作用，而能诱导形成芽，从而明确了腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。即这一比例高时，产生芽；这一比例低时，则形成根；相等则不分化。在寻找促进细胞分裂的物质过程中，Miller等人于1956年发现了激动素。不久即知道激动素可以代替腺嘌呤促进发芽，并且效果可增加3万倍。结果上述控制器官分化的激素模式变为激动素与生长素的比例关系。这方面的成功发现，有力地推动了植物组织培养的发展。1952年；Morel和Martin通过茎尖分生组织的离体培养，从已受病毒侵染的大丽花中首次获得无病毒植株。1935-1945年Muir把单细胞放在一张铺在愈伤组织上面的滤纸上培养，使细胞发生了分裂，即实施看护接种技术，使单细胞培养获得初步成功。1958年，英国科学家Steward等用胡萝卜根的愈伤组织细胞进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株，不但使细胞全能性理论得到证实，而且为组织培养的技术程序奠定了基础。三、植物组培的迅速发展阶段：1960年，Morel提出了一个离体无性繁殖兰花的方法，其繁殖系数极高。由于这一方法有很大的应用价值，很快被兰花生产者所采用，迅速建立起兰花工业。1960年，Cocking等人用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功。1971年，Takebe等在烟草上首次由原生质体获得了再生植株，这不仅在理论上证明了无壁的原生质体同样具有全能性，而且在实践上为外源基因的导入提供了理想的受体材料。80年代中期以来，对禾谷类作物的原生质体培养也相继告捷，在这方面中国学者做出了重要贡献。1962年，Murashinge和Skoog在烟草培养中筛选出仍被广泛使用的MS培养基。1964-1966年，印度科学家Guha和Maheswari在曼陀罗花药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株。1972年，Carlson通过两个种的烟草原生质体融合培养，获得了第一个体细胞杂交的杂种植株。Cocking等倡导的原生质体培养和体细胞杂交，研究得到了迅速发展，已经能使矮牵牛和烟草属的杂种细胞增殖分化生成杂种植株。在整个植物组织培养发展的历史中，我国学者做出多方面的贡献，除了前述的崔7徵的研究成效以外，还有1993年李继侗等关于玉米等植物离体根尖培养的研究工作，以及罗士韦关于幼胚和茎尖培养，李正理关于离体胚的研究培养、王伏雄等关于幼胚的研究培养工作。第二节：植物组培的应用植物组织培养成为生物科学的一个广阔领域，除了在基础理论的研究上占有重要地位以外，还在农业生产中也得到越来越广泛的应用。一、快速繁殖种苗(rapidpropagation)用组织培养的方法进行快速繁殖是生产上最有潜力的应用，包括花卉观赏植物、蔬菜、果树、大田作物及其他经济作物。快繁技术不受季节等条件的限制，生长周期短，而且能使不能或很难繁殖的植物进行增殖。快速繁殖可用下列手段进行：通过茎尖、茎段、鳞茎盘等产生大量腋芽；通过根、叶等器官直接诱导产生不定芽；通过愈伤组织培养诱导产生不定芽。试管快速繁殖应用在下列生产或研究中：(1)繁殖杂交育种中得到的少量杂交种，以及保存自交系、不育系等。(2)繁殖