100-黄瓜根分泌物中化感物质的鉴定及其化感效应

生态环境2007,16(3):[e-mail]基金项目：河南省教育厅科技攻关项目（200510466021）作者简介：胡元森（1976－），男，讲师，博士，研究方向为土壤微生物。Tel:[phone]；E-mail:[e-mail]收稿日期：2006-12-08黄瓜根分泌物中化感物质的鉴定及其化感效应胡元森1,2，李翠香1，杜国营2，刘亚峰2，贾新成21.河南工业大学生物工程学院,河南郑州450052；2.河南农业大学生命科学学院,河南郑州450002摘要：作物生长过程中能从根系分泌释放出化感物质，此类物质被认为是引起连作障碍的重要因子。为进一步明确黄瓜（CucumissativusL.）根分泌物中化感物质与其连作障碍间的关系，采用GC-MS分析法，鉴定了XAD-4吸附树脂收集黄瓜水培液所获得根分泌物化感物质的种类，并考察了根分泌物对黄瓜种子胚根伸长及鉴定出的酚酸类化感物质对黄瓜枯萎病菌菌丝生长的影响。结果表明：黄瓜根分泌物中化感物质主要有苯甲酸、对羟基苯甲酸，香草酸，阿魏酸，苯丙酸等苯甲酸的衍生物。根系分泌物酸性、中碱性组分对黄瓜胚根伸长都有抑制作用，其中酸性组分抑制作用更加明显。42h内，质量浓度低于50mg·L-1时，酚酸对枯萎病菌菌丝生长有刺激作用，而高于50mg·L-1时，对菌丝生长有抑制作用。随处理时间延长，枯萎病菌对酚酸物质的耐受性增强，对高质量浓度酚酸的生长抑制作用表现不明显。本研究为从根际微生态角度揭示连作障碍机理积累了重要数据。关键词：黄瓜；根分泌物；GC-MS；胚根；黄瓜枯萎病菌中图分类号：S625.5文献标识码：A文章编号：1672-2175（2007）03-0954-04连作障碍已成为制约一些地区蔬菜生产可持续发展的重要因素，它的发生不仅同土壤传染性病害和土壤理化性状变劣有关，也同根系分泌物和残茬分解物等引起的自毒作用有关[1-3]。黄瓜是温室种植面积最大且不耐连作的蔬菜品种之一，其连作常导致生长变差，品质下降，枯萎病、根结线虫病严重发生等现象[4]。许多研究表明，根分泌物中酚酸类化感物质能够通过多种途径对黄瓜植物产生不利影响，并被认为是黄瓜根分泌物中的主要化感因子[5-7]。但这一结论常常被质疑，原因是几乎所有的作物都能从根系分泌这些酚酸[8-10]。此外，尽管病害严重是许多作者在研究连作障碍时描述的一个现象，但造成这一现象的原因、这一现象与根分泌物化感物质间的关系却鲜见报道。本文分离鉴定了水培42d的黄瓜幼苗根分泌物中主要化感物质，并对分泌物抑制黄瓜种子萌发与胚根伸长及鉴定出的化感物质对枯萎病菌生长进行了测试，旨在为黄瓜连作障碍成因研究提供证据。1材料与方法1.1黄瓜品种及病原菌菌株供试黄瓜（CucumissativusL.）品种为津绿。黄瓜枯萎病菌（Fusariumoxysporum）由南京农业大学园艺学院曹清河博士惠赠，具有侵染能力。1.2实验方法1.2.1黄瓜培养条件蛭石育苗及黄瓜水培采用营养液配方参照文献[7]的方法。将消毒过的黄瓜种子放在铺有滤纸的培养皿内，加水使滤纸浸透，于30℃温箱催芽。看到芽尖后，将种子播于营养液浸透的蛭石中，室外培养。待第二片真叶展平时，取出生长均一的幼苗，用去离子水轻轻洗去蛭石，定植在两个盛上述营养液的培养器中。每培养器定苗8株。每7d换一次营养液，黄瓜连续培养6周。采用自动通气泵通气，培养温度夜25℃，昼35℃。用日光灯照明，光照强度约4000Lex。黄瓜生长期，定时补充水分，调整培养液pH值。1.2.2树脂预处理购置树脂（XAD-4型，Sigma公司）先用去离子水冲洗多次后，避光保存于甲醇中备用。树脂装柱(16mm×400mm)高度约250mm后，用去离子水洗去残存的甲醇(用水量不少于500mL)，然后用0.25%NaOH冲洗约3h，再用5倍柱床体积的去离子水冲洗，最后用0.25%HCl冲洗30min。1.2.3根分泌物的提取及纯化将黄瓜培养残液过XAD-4树脂柱(流速约5mL·min-1)，然后用10倍柱床体积的去离子水洗约2h以除去柱中的营养液成分。再用200mL甲醇洗脱根分泌物，收集甲醇洗脱液，用冷冻干燥机除去甲醇，加超纯水30mL溶解干燥后的根分泌物。用0.1mol·L-1HCl调pH至2.0，用乙醚萃取3次后弃水相(得酸性组分)。将水相用NaOH调pH至8.0，同样用乙醚萃取三次(得中、碱性组分)，弃水相。将酸性组分，中碱性组分中乙醚蒸发掉，加少量甲醇溶解后，加去离子水定容至5mL，一部分用于生物检测，一部胡元森等：黄瓜根分泌物中化感物质的鉴定及其化感效应955分用于GC-MS分析。1.2.4根系分泌物的硅烷化将上述酸性、中碱性组分分别进行冷冻干燥，在冻干的样品中加入0.25mL硅烷化试剂(BSTFA:吡啶=5:1)，加盖密封后于80℃水浴中衍生2h。1.2.5根分泌物的GC-MS鉴定硅烷化后的各组分根分泌物于河南省科学院分析测试中心质谱室采用17A/QP-5000GC/MS测定。采用电子轰击源，轰击电压70eV，扫描范围M/Z30工协作-450AMU，扫描速度0.4s扫全程，离子源温度250℃。毛细管柱：SE54（30m×0.25mm×0.25mm），进样口温度280℃，柱温120℃（3min），以15℃·min-1程序升温至250℃（保持3min）。载气为He，流量lmL·min-1，进样量为1μL。人工分析并与标准图谱核对，确定各组分物质结构及名称。1.2.6酸性、中碱性组分收集液对黄瓜种子胚根伸长影响分别取0.1、0.2、0.4和0.8mL酸性、中碱性组分根分泌物。事先将直径9cm滤纸片用无菌水浸透，并置于培养皿上，将上述根分泌物加入到培养皿中，摇匀。每个培养皿放10粒黄瓜种子于滤纸片上，25℃暗条件下培养，60h后测定胚根长度。实验重复进行3次，以3次测定胚根长度的平均值作为指标，评估酸性、中碱性组分收集液对黄瓜种子胚根伸长影响。1.2.7根分泌物中酚酸物质对枯萎病菌菌丝生长影响将三种酚酸分别添加到PDA培养基中，使之质量浓度分别达到0.01、0.025、0.05、0.1和0.15mg·L-1。预先用PDA培养基培养黄瓜枯萎病菌，待菌落直径约5cm时，用打孔器(直径为0.5cm)取菌落边缘取长势一致的菌丝，接入到添加不同量酚酸的PDA培养基中。26℃培养42h和64h后测定菌落直径大小。每个处理三个重复，以不加酚酸的处理作为对照（5个重复）。2结果2.1根分泌物中主要物质的GC-MS分析根分泌物酸性组分、中碱性组分的气相色谱图见图1，图2。从图中可知，在根分泌物酸性组分中检测出苯甲酸、苯丙酸、对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、丁二酸、2.4-已二烯二酸及三种烷酸等物质，其中前五种都是已被发现存在于多数植物根分泌物中的化感物质[10-11]。丁二酸是三羧酸循环中的一种机酸，不是化感物质。2.4-已二烯二酸也未发现具有化感效应。4-羟基-噻吩并[3.2.C]吡啶可能是一种潜在的化感物质，但目前没有其标准品，其化感活性有待于验证。在中碱性组分中检测出丙三醇、脯氨酸、及二种甲基脂类物质，这也似乎并不是根分泌物中的化感物质。在酸性组分中，未发现与已报道的非酚酸类化感物质相似的成分。2.2酸性、中碱性组分收集液对黄瓜种子胚根伸长影响上述酸性、中碱性组分收集液对黄瓜种子胚根伸长的影响见表1，从表中可以看出，从分泌物中图1根分泌物酸性组分气相色谱图Fig.1Gas-chromatographpatternofacidcomponetofcucumberrootexudates.1.磷酸；2.苯甲酸；3.2,4-已二烯二酸；4.苯丙酸；5.对羟基苯甲酸；7.丁二酸；8.十四碳酸；10.香草酸；16.十六碳酸；17.十八碳酸；18.阿魏酸图2根分泌物中碱性组分气相色谱图Fig.2Gas-chromatographpatternofalkalinemixturesofcucumberrootexudates.1.磷酸;2.丙三醇;3.苯甲酸苯甲酯;4.脯氨酸;6.十六烷酸甲基脂;8.4-羟基-噻吩并[3,2,C]吡啶956生态环境第16卷第3期（2007年5月）萃取得到的酸性组分和中碱性组分对黄瓜胚根生长均具抑制作用，其抑制效果随其收集液添加量的增加而增强。与中碱性组分相比，酸性组分的抑制活性更加明显。2.3根分泌物中酚酸物质对枯萎病菌菌丝生长的影响几种酚酸物质对黄瓜枯萎病菌菌丝生长影响见表2。从表中可见，培养42h后，苯甲酸、对羟基苯甲酸、香草酸、苯丙酸质量浓度在50mg·L-1及以下时，对枯萎病菌菌丝生长都具有促进作用，其中，苯甲酸、对羟基苯甲酸在25mg·L-1时刺激作用显著。而这几种酚酸在高于50mg·L-1时对病菌菌丝生长表现出抑制作用，150mg·L-1的苯甲酸及100mg·L-1和150mg·L-1的苯丙酸对菌丝生长抑制极显著。值得注意的是，阿魏酸在10mg·L-1和25mg·L-1时均表现出显著的菌丝生长刺激作用，在质量浓度高达100mg·L-1时这种刺激作用仍然存在，但在150mg·L-1时又表现出显著的抑制作用。64h后菌丝生长似乎对高浓度酚酸的抑制作用具有耐受性。几种酚酸处理后，黄瓜枯萎病菌菌丝生长更多地表现出刺激生长作用。如高浓度对羟基苯甲酸处理42h后，菌丝生长受到抑制，但在64h后，菌丝生长又表现出微弱的刺激作用。而在42h表现出显著抑制作用的150mg·L-1的苯甲酸、阿魏酸和100mg·L-1的苯丙酸，在64h后抑制作用也有减弱。3讨论本文研究表明，酸性组分能显著抑制黄瓜胚根伸长，而中碱性组分抑制能力随添加量增加而变化不大，这说明起化感抑制作用的物质主要存在于酸性组分中，化学鉴定进一步证实了这一观点。在酸性组分中检测到苯甲酸，对羟基苯甲酸，香草酸，苯丙酸，阿魏酸等苯甲酸的衍生物，这些化合物已被证明在黄瓜根系分泌物中存在，并对黄瓜生长起自毒作用[12]。虽然中碱性组分也表现出一定的抑制作用，但在随后的化学鉴定中未检测到与已报道化感作用物质相同的成分，这可能是实验中根系分泌物收集量过少所致。在中碱性组分中，稠杂环化合物4-羟基-噻吩并[3,2,C]吡啶有可能是潜在的化感物质，但目前仍没有此标准品生产，其化感活性还无法验证。在质谱检测时，峰值较大的都是一些脂肪酸，脂类物质，峰值较低的才可能是要分析的根分泌物中的化感物质。因此，上述报告的化感物质只是根分泌物中的一部分，可能还有一些分泌量较少，但毒性较强的化感物质没有被检测出来。值得一提的是，除根系分泌物以外，黄瓜植株淋溶物、残茬分解物乃至自身挥发物也有可能导致产生自毒作用物质。但在大田复杂条件下，这些化感作用物质在何种程度上影响黄瓜生长还有待于研究。本文研究表明，低质量浓度的酚酸对黄瓜根部枯萎病菌菌丝生长有刺激作用，吴凤芝等用连作土壤浸出液及土培黄瓜根系分泌物也得出相似结果[12]。此外，研究表明酚酸物质对黄瓜幼苗根表皮细胞细胞膜造成损伤[13]，影响根部对养分的吸收[5]，抑制作物种子萌发及幼苗生长[9,14]等，可见，根分泌物中酚酸物质对黄瓜连作病害发生有双重作用，一方面它使植株本身受到伤害，使其生长势变弱，抗逆性下降。另一方面，它直接刺激病原菌的生长，使作物连作以最直观的表象——土传病害增加的形式表现出来。表1根分泌物收集液中酸性、中碱性组分不同添加量对黄瓜种子胚根伸长影响Table1Effectofacid,neutralandalkalinefractionofcucumberexudatesontheelongationofradicle添加量/mL胚根长/mm对照酸性组分中碱性组分0.150.548.351.90.247.857.00.445.042.20.835.645.6表2酚酸物质对黄瓜枯萎病菌菌丝生长影响Table2Theeffectofphenoliccompoundsonhyphagrow