原代细胞培养实验(2010-2011-2)

原代细胞培养实验费晓芳掌握无菌操作技术。了解小鼠解剖操作技术。了解原代细胞培养的一般方法与步骤。了解培养细胞的消化分散。了解细胞计数方法。了解倒置显微镜的使用。实验目的和要求：实验原理：原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。实验内容：动物的选择：选择大约一半足孕时间的胚胎，10－13天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞，成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。每组小鼠胚胎2-5个实验材料：每组的超净台中有以下物品：1.50ml配制好的RPMI1640培养液1瓶；8ml小牛血清（FCS)1瓶；100ml0.25%胰蛋白酶1瓶；PBS(-)1瓶2.100ml灭菌烧杯2个；3、50ml离心筒2个4、灭菌培养皿1个，细胞培养瓶1个4、1ml，200μl移液器各1支；枪头盒2个；无菌玻璃搅拌棒1个5、细胞计数板1块；6、灭好菌的镊子1把，剪刀1把；7、酒精灯1台；试验操作步骤：1)胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠)a．采用认可的方案处死啮齿动物。b．立即在无菌超净台内用70％乙醇擦洗整个动物。c．用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。d．用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。e．剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌PBS的100ml烧杯中。f．漂洗胚胎，去掉PBS。继续用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。仔细清洗小鼠腹部2)将1－2个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎，用PBS漂洗。3)在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一50ml的无菌离心筒中,加入40ml0.25％的无菌胰蛋白酶,用搅拌棒轻轻搅动。4)在温暖的环境中或置于37°C培养箱中轻轻摇动15分钟。5)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照每10ml上清加入lml小牛血清的比例加入牛血清以灭活,胰蛋白酶。6)加人新鲜胰蛋白酶溶液(见前述步骤)于含有残留未消化组织块的原来的50ml离心筒中，重复步骤4和5。7)离心混合的细胞悬液，1200r／rain，5分钟，弃上清。8)用新鲜的无菌PBS重悬沉淀的细胞，按步骤7再次离心。9)用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止。10)用含有10％牛血清和抗生素(如青霉素、链霉素)的DMEM(GIBCO／BRL)lOml再悬沉淀，并使终体积为20ml。11)让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降。可采用数层无菌纱布过滤细胞悬液以去除任何残留的细胞块。12)为确定现有细胞浓度，加入0.2ml细胞悬液于1.8ml1％醋酸溶液中以裂解红细胞，用血细胞计数器进行细胞计数。（细胞记数方法见传代培养课件）13)按每细胞瓶Ix106细胞的数量接种于10ml组织培养液中，在饱和湿度的37℃C02培养箱中孵育直至细胞铺满。14）24小时后即可观察。细胞记数1.按上述方法，用胰蛋白酶处理细胞，细胞重悬于细胞培养液中。2.用沾有70%酒精的棉球擦净细胞计数板和盖玻片，盖玻片放好在细胞计数板上。3.用移液器吸取细胞标本10μl，加入10μl台盼氏兰溶液混匀，吸取10μl混合液从盖玻片的一侧将混合液打入盖玻片与计数板之间。4.在显微镜下，计数或细胞。5.计数细胞计数板每一小室中，上下左右角和中间的大方格中（5个格）的细胞数。6.在取一细胞样品，同上在细胞板的另一小室计细胞数。7.合计10个大方格中的细胞。算出110-3ml的细胞数。（每个大方格110-4ml10个大方格10-3ml溶剂）细胞总数乘以1000即得每毫升计数细胞悬液的细胞数。8.计数完毕，用双蒸水清洗细胞计数板和盖玻片。用擦净纸擦干。每毫升细胞总数=[(A1+B1+C1+D1+E1)+(A2+B2+C2+D2+E2)]观察培养情况