Y染色体微缺失

Y染色体微缺失检测迪安医学检验中心一、背景•1全球不育夫妇占已婚夫妇10%-15%•2其中男性原因占40%-50%•3遗传因素占男性不育的30%•410%~15%的特发性无精症存在Y染色体的微缺失二Y染色体微缺失相关基因•Y染色体是最短的近端着丝粒染色体,是男性特有的染色体。1976年，Tiepolo和Zuifaidi首先提出Y染色体上有多个基因参与生精过程。多年研究，发现男性特有的Y染色体上面存在一个关键的与生育相关的因子的区域，称为AZF区。目前认为在AZF区上存在四个精子发生亚区（AZFa、AZFb、AZFc、AZFd），各亚区包含的位点在男性生殖细胞发育的不同时期起着不同的作用，位点的缺失可致患者表现为少、弱精症或无精症从而引发不育。•一般认为，Y染色体的近端缺失（涉及AZFa和AZFb），表现以唯支持细胞综合症为主的严重生精障碍，Y染色体的远端缺失（涉及AZFd和AZFc），可残留岛状的生精正常区域。对无精症患者中，对检查睾丸过小或睾丸活检仍无精子患者，一般不再行AZF基因检测。总之，开展染色体和AZF检测，可全面评价男性不育遗传缺陷，从而更好的解释发病原因，提供遗传咨询和指导临床诊疗。•1996年将AZF区划分为3个区:AZFa、AZFb、AZFc。1999年研究发现在AZFb和AZFc间存在AZFd。研究发现,在Y染色体AZFa、AZFb、AZFc3个区至少发现15个与精子发生相关的基因，AZFd区尚未发现相关基因。二Y染色体微缺失相关基因•AZFa缺失的病人,主要表现为唯支持细胞综合征伴睾丸体积缩小,无精子生成•AZFb缺失的病人主要表现为生精过程阻滞在精母细胞阶段,无精子生成•AZFc区缺失病人表现多样化,会出现无精子症和少精子症的不同临床表现二Y染色体微缺失相关基因•AZFa缺失患者33%为严重少精子,67%表现为无精子•AZFb缺失患者9%轻度少精子,23%严重少精子,68%无精子•AZFc缺失患者46%严重少精子,54%无精子二Y染色体微缺失相关基因•AZFa-b缺失患者50%严重少精子50%无精子•AZFa-c缺失患者100%无精子•AZFb-c缺失患者4%严重少精子,96%无精子二Y染色体微缺失相关基因•AZFa缺失较为少见,占整个AZF缺失4.9%。整个AZFa区域缺失通常表现为SCOS,为绝对的无精子症。若患者为AZFa缺失,不建议做睾丸穿刺寻找精子进行卵细胞胞质内单精子注射，目前只能寻求供精人工授精技术来获得妊娠。二Y染色体微缺失相关基因•AZFb缺失也不多见,占整个AZF缺失15.8%。缺失的典型睾丸组织学特征是精子成熟障碍,主要停滞在初级精母细胞阶段。但也有SCOS的报告，睾丸穿刺不能获得精子,因此,临床上也不建议做睾丸穿刺。二Y染色体微缺失相关基因•AZFc缺失是临床上最常见的AZF缺失类型,临床和睾丸组织学表型多种多样。一般说来,AZFc缺失患者尚存精子生成能力。AZFc缺失见于无精子症或严重少精子症患者,罕见情况下,也可以在自然状态下遗传给其男性后代•在无精子症患者中,AZFc缺失者通过睾丸精子穿刺获得精子的机会比其他缺失类型大,同时可以从睾丸穿刺获得精子进行ICSI受孕,但这些患者的男性后代都将是AZFc缺失的携带者，建议在进行试管婴儿前,行遗传咨询。三AZF微缺失与其他不育因素•AZF微缺失与隐睾症•AZF微缺失与精索静脉曲张•AZF微缺失与双侧输精管缺如•AZF微缺失与睾丸支持细胞•AZF微缺失与生殖激素异常•AZF微缺失与其他不育因素四Ｙ染色体微缺失的检测方法•核型分析总体上来说操作繁琐、效率不高,尤其是难以检测出微小的染色体异常或变异。荧光原位杂交(Fluorescenceisituhybridization,FISH)虽然有更高的分辨率,但其检测的范围为20kb~5Mb,对于微小的染色体缺失也难以检测,且繁琐的实验操作与高昂的成本也限制了FISH技术在临床中的广泛应用。四Ｙ染色体微缺失的检测方法目前关于Ｙ染色体微缺失的检测方法最常用的是多重聚合酶链反应(ＰＣＲ)技术而检测的位点有很多但有研究表明ＳＹ８４ＳＹ１５２ＳＹ１２７ＳＹ１４７\ＳＹ２５４-ＤＡＺ和ＲＢＭＹ１这６个基因标志物能覆盖大部分已发现的微缺失其他的位点序列灵敏度比较低,当然不同种族间可能会有轻微的差异四Ｙ染色体微缺失的检测方法•由于不同实验室采用PCR方法不同,导致实验结果各异。为提高诊断质量，欧洲男科协会(EAA)和欧洲分子遗传实验质控网(EMQN)在1999、2004年先后颁布了第1版和第2版Y染色体微缺失分子诊断指南，规范了检测微缺失时的Y染色体序列标签点(sequencetargetedsites，STS)与所采用的内外对照方法。四Ｙ染色体微缺失的检测方法•选择位于Y染色体短臂(Yp)的睾丸决定基因(SRY)和锌指蛋白基因(ZFX／ZFY)为对照。ZFX／ZFY既存在于x染色体短臂，也存在于Yp，其与SRY一起构成2个目前推荐使用的参照基因。每个AZF区域至少设置2个STS位点才能正确有效.•其推荐的STS为AZFa：sY84，sY86：AZFb：sY127，sY134；AZFc：sY254，sY255。多重PCR实验中的引物应包括：sY14(SRY)，zFY，，sY84，sY86，sY127，sY134，sY254，sY255。五染色体微缺失相关基因研究的意义1用于原发性无精或少弱精症的遗传咨询。通过遗传病因诊断，找到男性不育的遗传病因，则可避免不必要的药物及手术治疗。2进行辅助生育之前对其进行遗传病因诊断，可尽量避免将不良基因传递给下一代3辅助生育精子质量筛选4为未来的基因治疗提供理论依据。五染色体微缺失相关基因研究的意义•为临床治疗各种男性不育提供分子或细胞水平的依据，Ｙ染色体微缺失虽然不会影响身体健康和心理健康，但会导致后代出现同样的不育问题对于不育夫妇，特别是无精子症和严重少精症的不育夫妇，虽然其可以通过ＩＣＳＩ达到妊娠的目的，并且有正常的胚胎发育和足月妊娠，但在接受ＩＣＳＩ治疗之前有必要进行Ｙ染色体微缺失的检测以及移植前遗传诊断，尽量选择女婴，切断遗传途径。EGFR突变与非小细胞肺癌酪氨酸激酶抑制剂靶向治疗一背景•肺癌是当今世界上最常见的恶性肿瘤,男性肺癌占各类恶性肿瘤发病率的首位,女性肺癌发病率仅次于乳腺癌占第2位。•尽管手术和化疗技术不断提高,但肺癌患者的预后仍然很差,5年生存率仍20%。•近年来随着分子生物学技术的提高,产生了一些针对分子靶点的抗肿瘤药物。这些药物针对性强,能特异性地杀伤肿瘤细胞。•其中以表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)为靶点的分子靶向治疗(moleculartargetedtherapy)在非小细胞肺癌的治疗中日渐突出。•EGFR属于受体酪氨酸激酶(receptortyrosinekinases,RTKs),调控细胞的生长、分化、血管生成及凋亡抑制,其信号通路与恶性肿瘤的生长、侵袭及转移关系密切。•靶向药物称作酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinasesinhibitors,TKIs),其中吉非替尼(Gefitibib,商品名为Iressa易瑞沙)和埃罗替尼(Erlotinib,商品名为Tarceva特罗凯)治疗可以使肿瘤缩小。•在Gefitibib和Erlotinib的临床试验和治疗中,仅有一部分NSCLC人群对药物有反应•发现几乎所有对TKIs敏感的NSCLC患者都存在EGFR基因的体细胞突变。因此,研究NSCLC患者不同治疗反应性的机制、以及从中筛选出最适治疗对象进行有针对性的治疗具有重要临床意义。EGFR基因突变与TKIs治疗敏感性•文献报道：肺癌细胞中EGFR酪氨酸激酶编码区基因突变是靶向药物奏效的一个必要前提条件,研究结果显示,对EGFR突变型NSCLC,Gefitinib的有效率高达80%以上,而对野生型肿瘤则基本无效。这一研究随后被相继其它研究所证实。•EGFR基因位于7号染色体短臂7p12～14区,由28个外显子组成。EGFR在许多肿瘤中过表达,与肿瘤的生长侵袭及转移密切相关。•在肺癌中,EGFR突变多出现于外显子18～21区。最常见的突变包括19区的缺失突变(deletion)和21区的点突变(pointmutation),这两种突变约占所有EGFR突变的85%～90%。•外显子19区的碱基缺失主要是第746～752位密码子的缺失突变,导致EG2FR蛋白中氨基酸序列丢失,这一缺失改变了受体酪氨酸激酶ATP结合槽(ATP2bindingcleft)的角度,从而改变了细胞对TKIs的敏感性。•外显子21的点突变主要是第858位密码子出现T→G转换,引起EGFR蛋白中该位点的氨基酸由亮氨酸转变为精氨酸(简称L858R),此种结构改变也使细胞对TKIs的敏感性发生变化•其他EGFR突变比较少见,包括外显子18区的点突变和外显子20区的插入突变TKIs治疗耐受与EGFR二次突变•并不是所有的EGFR突变都会导致对Gefitinib或Erlotinib敏感性的增加,对Gefitinib或Erlotinib最初有反应的患者可发生二次突变而出现TKI治疗耐受。如T790M,发生在EGFR外显子20区,编码的苏氨酸转变为甲硫氨酸;氨基酸的改变导致了ATP结合区结构改变,使得细胞对TKIs的敏感性降低。T790M突变也可出现在未做治疗的患者中,因此,对于EGFR不同突变的功能有必要进一步研究,以明确某个或某几个突变是筛选适合TKIs治疗患者的最佳指标。EGFR基因扩增和CA重复序列的多态性•表达EGFR或存在EGFR基因扩增的患者对Erlotinib治疗反应好,并且生存率得到明显提高。•研究发现：EGFR的高拷贝数与对药物较好的反应率、疾病控制率和存活率相联系。•EGFR蛋白的高表达与好的治疗结果之间的关联度则次之。•同时EGFR突变与较好的反应率和预后有关。•但进一步的统计分析表明只有高的EGFR基因拷贝数对应较高的存活率。•因此说明,EGFR基因扩增可作为筛选TKIs治疗的指标之一。•研究发现,位于EGFR内含子1的CA重复序列的多态性可影响EGFR的蛋白表达,低重复CA数患者EGFR的RNA和蛋白表达高于高重复CA数的患者,体外实验也证实低重复CA数细胞对Gefitinib的敏感性较高。EGFR家族其他成员—HER2/HER3•HER2可与EGFR结合形成异源二聚体,引发受体自身磷酸化过程。有研究认为,HER22基因拷贝数增加的肿瘤对Gefitinib更敏感。但亦有研究发现,FISH(原位荧光杂交)检测HER2或HER3阳性肿瘤与阴性肿瘤相比,两组患者的病程进展时间及平均存活时间均没有显著差异。但是在体外细胞株的实验中,不论有无EGFR突变存在,HER2和(或)HER3高表达的细胞表现出对Gefitinib较高的敏感性。K-RAS基因突变•K-RAS是EGFR信号通路下游的基因。与EGFR基因突变相反,K-RAS突变常见于吸烟者和分化差的肿瘤。而且发生K-RAS突变的NSCLC并不同时出现EGFR突变,这两种基因的突变是互相排斥的,提示K-RAS突变可以作为肿瘤对TKIs治疗不敏感的指标,这部分患者应采用其他方式的治疗。总结•综上所述,以EGFR受体酪氨酸激酶为靶点抗肿瘤药物已经成为晚期肺癌治疗的一种新选择。由于NSCLC中EGFR基因突变与TKIs治疗敏感性显著相关,临床上应根据EGFR突变情况来选择用药。针对TKIs不敏感的患者,需要发展可对抗EGFR二次突变以及其他调控分子的新的靶向药物。