7发酵工艺实例介绍

第六章发酵工艺实例介绍IntroductionHistoryofaminoacidsproduction:Thestoryofstartedin1908Isolatedglutamicacid,delicioustasteScreenforamino-acid-excretingmicroorganisms:Corynebacteriumglutamicum,In1957.Monosodiumglutamate(MSG):Aflavor-enhancingcompound氨基酸的生产方法：1.抽提法：最早采用的生产法，用酸水解蛋白质，然后从中提取氨基酸。得到的是各种氨基酸的混合物。碱性或酸性氨基酸容易些，胱氨酸，半胱氨酸，酪氨酸仍用此法生产。2.发酵法：目前最常用的方法。成本低，原料来源丰富。包括直接发酵法(利用微生物直接由粮食原料生产氨基酸)和添加前体物质发酵法（以氨基酸中间产物为原料，用微生物转化为相应的氨基酸，可避免氨基酸生物合成途径中的反馈抑制作用）。3.酶法：用微生物细胞抽提出的酶类来制造氨基酸，若采用固定化酶或固定化菌体，优点则更明显。4.化学合成法：蛋氨酸，甘氨酸得到的DL-氨基酸，若需要L-型的，则进行化学异构体的拆分。L-苯丙氨酸（阿斯巴甜）人体八种必需氨基酸：苏缬亮异亮色苯蛋赖氨基酸工业历史：氨基酸工业起源于日本，1908年日本人发现海藻昆布的鲜味来自其汁液所含的谷氨酸。根据这个发现，次年味之素公司开始工业化生产谷氨酸钠。当时谷氨酸的生产是通过水解面筋或大豆蛋白获得的。半个世纪以后，1957年，日本科学家发现培养某些微生物（如谷氨酸棒杆菌）会产生氨基酸的积累，并采用微生物发酵法生产谷氨酸获成功。这项成果被誉为现代发酵工业的重大创举，使发酵工业进入了代谢调控阶段。谷氨酸是第一种应用发酵法进行工业化生产的氨基酸，也是目前产量最高的氨基酸。我国氨基酸工业虽然起步早（1964），但品种单一，多数厂家只生产谷氨酸。第一节味精人的味觉除了原本发现的酸甜苦咸等四种外，还有第五种基本味觉，即“甘旨味”，俗称鲜味。以谷氨酸钠（味精）最具代表性。为什么味精是谷氨酸的钠盐？谷氨酸与其他氨基酸共同组成蛋白质时，隐藏于蛋白质分子中，无法刺激味蕾呈现鲜味。若从蛋白质中释放出来成为游离氨基酸，形成谷氨酸钠时，会表现出特别的鲜味。一、概述-早期—从天然的食物材料中取得海带以热水煮过后，取其汤浓缩即可得到含味精的浓缩液。-中期—最早商业化制造味精的原料是面筋。20kg小麦面粉可生产1kg味精。因为谷氨酸钠在植物蛋白中含量丰富。-近期—糖是生产味精的主要原料。1958年利用微生物生产味精，以葡萄糖，淀粉水解糖经味精生产菌代谢合成大量谷氨酸钠。放味精有学问：宜放于不明显呈酸碱性食物中，注意温度味精的安全性：1995年美国食品药品管理局公布了一份报告还味精一个清白，结论是食用味精是安全的，且对人体有三大重要性：1.生物体内氨基酸和碳水化合物的桥梁。2.人体合成必需氨基酸所需材料。3.增加人的摄食量，改善营养状况和身体免疫力。二、谷氨酸的生物合成机理1.谷氨酸（a-氨基戊二酸）O∥C-OH第一代鲜味剂∣H2N-C-HL-谷氨酸单钠盐——味精∣H-C-H∣H-C-H∣H-C=OOHL-型2.谷氨酸的生物合成NH4＋葡萄糖→中间产物→α-酮戊二酸→谷氨酸→谷氨酸脱氢酶葡萄糖↙6-P-葡萄糖→6-P-葡萄糖酸（HMP:Hexosemonophosphatepathway）↓↓3-P-甘油醛←5-P-核糖↓丙酮酸→乙酰CoA↓↓草酰乙酸→柠檬酸↑↓苹果酸异柠檬酸↑↙↓延胡索酸←琥珀酸α-酮戊二酸↓谷氨酸←透过细胞膜←谷氨酸（图）（1）EMP:丙酮酸，ATP,NADH2（2）HMP:6－磷酸果糖→丙酮酸3－磷酸甘油酸↗NADPH2:a－酮戊二酸还原氨基化必需的供氢体。（3）TCA循环:生成谷氨酸前体物质a－酮戊二酸。（4）CO2固定反应:补充草酰乙酸。P255（5）乙醛酸循环:使琥铂酸、延胡索酸和苹果酸的量得到补充，维持TCA循环的正常运转。P256谷氨酸脱氢酶（6）还原氨基化反应:a－酮戊二酸→谷氨酸问：丙酮酸进入TCA循环时会形成CO2，在谷氨酸发酵中，微生物怎样固定CO2以提高谷氨酸产率的？回补反应（附图）3.谷氨酸生产菌的生化特征P256（1）有苹果酸酶和丙酮酸羧化酶。（2）a－酮戊二酸脱氢酶活性弱，异柠檬酸脱氢酶活性强，异柠檬酸裂解酶活性弱。（3）谷氨酸脱氢酶活性高，经呼吸链氧化NADPH2的能力弱。（4）菌体本身利用谷氨酸的能力低。4.谷氨酸产生菌P238（全是细菌）棒杆菌属北京棒杆菌C.pekinenseCorynebacterium钝齿棒杆菌C.crenatum谷氨酸棒杆菌C.glutamicum短杆菌属黄色短杆菌B.flvumBrevibacterium产氨短杆菌B.ammoniagenes小杆菌属嗜氨小杆菌M.ammoniaphilumMicrobacterium节杆菌属球形节杆菌A.globiformisArthrobacter共同点：P2381）革兰氏阳性。2）不形成芽孢。3）没有鞭毛，不能运动。4）需要生物素作为生长因子。5）在通气条件下产谷氨酸（需氧微生物）。三、谷氨酸发酵的工艺控制（一）培养基1.碳源：淀粉水解糖、糖蜜、乙醇、烷烃（1）淀粉水解糖的制备（2）糖蜜原料2.氮源：铵盐、尿素、氨水C/N＝100：15～21，实际高达100：28因为：1）用于调整pH。2）分解产生的NH3从发酵液中逸出。产酸阶段：NH4+不足：使a-酮戊二酸蓄积而很少有谷氨酸生成。NH4+过量：促使谷氨酸生成谷氨酰胺。碳氮比对谷氨酸发酵有很大影响，大约85%的氮源用于合成谷氨酸，15%用于合成菌体。谷氨酸发酵需要的氮源比一般发酵工业多的多，一般100：0.2-2.0，而谷氨酸C/N为100：15-21。3.无机盐：磷酸盐、镁、钾、钠、铁、锰、铜，其中磷酸盐对发酵有显著影响。不足：糖代谢受抑制，菌体生长不足。过多：a.细胞膜磷脂生成量多，不利于谷氨酸排出。b.促使丙酮酸和乙醛（由丙酮酸脱羧生成）缩合生成缬氨酸的前体物——a－乙醛乳酸，使缬氨酸在发酵液中蓄积。4.生长因子：生物素作用：影响细胞膜通透性和代谢途径。（1）作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA的辅酶，参与脂肪酸的生物合成，进而影响磷酯的合成。（2）浓度过大：促进菌体生长，谷氨酸产量低。因为：-酮戊二酸生成量减少。a.乙醛酸循环活跃，b.转氨酶活力增强，谷氨酸转变成其它氨基酸。生物素：B族维生素的一种，又称维生素H或辅酶R。是合成脂肪酸所必需的。脂肪酸的生物合成：利用乙酰CoA（直接原料是丙二酸单酰CoA）在乙酰CoA羧化酶（辅基为生物素）催化下合成。脂肪酸＋甘油磷酸╰╯磷脂＋蛋白质╰╯生物膜因此，脂肪酸是组成细胞膜类脂的必要成分。生物素限量，不利于脂肪酸的合成，有利于谷氨酸透过细胞膜分泌至体外。使胞内代谢产物迅速排出的方法1.用生理学手段——直接抑制膜合成或使膜受缺损如:Glu发酵中，控制生物素亚适量可大量分泌Glu；当培养液中生物素含量较高时采用适量添加青霉素的方法；2.利用膜缺损突变株——油酸缺陷型、甘油缺陷型如:用谷氨酸生产菌的油酸缺陷型，培养过程中，有限制地添加油酸，合成有缺损的膜，使细胞膜发生渗漏而提高谷氨酸产量。甘油缺陷型菌株的细胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造成谷氨酸大量渗漏。应用甘油缺陷型菌株，就是在生物素或油酸过量的情况下，也可以获得大量谷氨酸。控制细胞膜的渗透性(1)通过生理学手段控制细胞膜渗透性(2)通过细胞膜缺损突变控制细胞膜渗透性工业上利用谷氨酸棒状杆菌大量积累谷氨酸，应采用的最好方法是（）A．加大菌种密度B．改变碳源和氮源比例C．改变菌体细胞膜通透性D．加大葡萄糖释放量为什么添加适量生物素或青霉素可提高谷氨酸产量？生物素：乙酰-CoA羧化酶的辅酶，与脂肪酸及磷脂合成有关。控制生物素含量，可改变细胞膜的成分，改变膜的透性、谷氨酸的分泌和反馈调节。生物素含量高时，细胞膜致密，阻碍Glu分泌，并引起反馈抑制，加适量青霉素可提高Glu产量。青霉素：抑制肽聚糖合成中的转肽酶活性，引起肽聚糖结构中肽桥无法交联，造成细胞壁缺损，在膨胀压的作用下代谢物外渗，降低了谷氨酸的反馈抑制，提高了产量。（二）pH的影响及其控制作用机理：主要影响酶的活性和菌的代谢。在氮源供应充分和微酸性条件下，谷氨酸发酵转向谷氨酰胺发酵。pH控制在中性或微碱性。方法：流加尿素和氨水。（三）温度的影响及其控制菌体生长达一定程度后开始产生氨基酸，菌体生长最适温度和氨基酸合成的最适温度不同。菌体生长阶段：30-34℃产酸阶段：34-36℃（四）溶解氧的控制P258，265大小由通风量和搅拌转速决定。发酵产酸阶段，通风量要适量。不足：发酵液pH值偏低，生成乳酸和琥珀酸，谷氨酸少。-酮戊二酸蓄积。α-酮戊二酸还原氨基化，使过大：NADPH2通过呼吸链被氧化，影响环境条件引起谷氨酸合成的代谢转换P263-266控制因子产物氧(不足)乳酸或琥珀酸←→谷氨酸(充足)←→α-酮戊二酸(过量)NH4+(不足)α-酮戊二酸←→谷氨酸(适量)←→谷氨酰胺(过量)P243生物素谷氨酸(限量)←→乳酸或琥珀酸(充足)P263pH(酸性)N-乙酰-谷氨酰胺←→谷氨酸(中性或微碱性)P266磷酸盐(适量)谷氨酸←→缬氨酸（高浓度）P265四、下游过程（一）谷氨酸的提取方法1.等电点沉淀法：P283原理：谷氨酸在等电点处溶解度最小。介稳区：过饱和溶液，但过量的溶质并不马上结晶析出，溶液具有相对稳定性。（1）水解等电点法（2）低温等电点法（3）低温连续等电点法2.不溶性盐沉淀法（1）锌盐法pH6.3加酸pH2.4谷氨酸＋锌离子→谷氨酸锌沉淀→溶液→谷氨酸结晶原理：谷氨酸与锌离子形成谷氨酸锌沉淀，加酸溶解，再将pH调至2.4，析出谷氨酸结晶。（2）盐酸盐法：Glu在浓盐酸中生成并析出谷氨酸盐酸盐。这是用盐酸水解面筋生产谷氨酸的原理。即HCl＞10%时变得难溶。（3）钙盐法：高温谷氨酸钙溶解度大，与菌体等不溶性杂质分开，降温，析出谷氨酸钙沉淀，加NaHCO3直接得到味精。4.离子交换法离子交换树脂由母体（骨架）和活性基团（与溶液中同性离子交换）组成。用阳离子交换树脂吸附谷氨酸形成的阳离子，再用热碱（60℃4%NaOH）洗脱，收集相应流分，加盐酸结晶。GA+GA±GA-GA=23.227.012↓pIa.谷氨酸是酸性氨基酸，含2个羧基1个氨基，与阴离子交换树脂要比与阳离子交换树脂强，但阴离子机械强度差，价格贵，因而用阳离子交换树脂。理论上讲发酵液上柱的pH值应低于3.22，但实际上控制在5.0~6.0之间。P303原因：因Na+、NH4+交换能力谷氨酸，优先交换，置换出H+使pH值低于3.2，使谷氨酸成为阳离子，但不能6.0。b.洗脱与再生一般用NaOH（4%）洗脱。再生用HCl（5-10%）。以上三个方法也可结合起来用，如等电点锌盐法，等电点离子交换法。4.电渗析法P315。膜分离过程，利用的是电位差。二次电渗析法：pH3.2：除去各种盐类。pH3.2:除去蛋白质、残糖和色素等非电解质。（二）味精制造谷氨酸溶于水→活性炭脱色→加Na2CO3中和→谷氨酸单钠（味精粗品）→除铁→过滤→活性炭脱色→减压浓缩→结晶→离心分离→干燥→成品1.中和：碱碱过量谷氨酸→谷氨酸钠→谷氨酸二钠（无鲜味）关键：防止谷氨酸二钠的生成。措施：用碳酸钠中和时，pH值控制在6.7～7.0之间。2.中和液除铁、锌原料，设备，盐酸，碱→铁不符合食品标准，Fe2+过多，影响色泽。锌盐法提取谷氨酸→锌方法：a.沉淀法：Na2S法，使Fe2+，Zn2+沉淀除去。b.离子交换法：阳离子交换树脂。优点：除Fe2+完全，无污染（Na2S法产生硫化氢气体）。3.脱色：吸附法——活性碳离子交换法4.浓缩：除去大量水分，使溶液达到过饱和状态，采用减压浓缩（因为高温脱水生成焦谷氨酸钠）。5.结晶：将溶液浓缩到介稳区内。起晶方法：刺激起晶——粉末晶种起晶——