环己酰亚胺对烟草疫霉菌的抑制作用测定

第4卷　第1期2008年4月Vol.4　No.1Apr.　2008烟草农业科学TobaccoAgriculturalScience环己酰亚胺对烟草疫霉菌的抑制作用测定*夏振远1，孔光辉1，雷丽萍1，李铭刚2（1.云南省烟草科学研究所，云南玉溪653100；2.云南大学省微生物研究所，云南昆明650091）摘　要：利用室内生物测定法测定了环己酰亚胺对烟草疫霉的菌丝生长、孢子萌发的抑制作用，并利用盆栽法评价了环己酰亚胺对烟株黑胫病的效果进行药效评价。结果表明：环己酰亚胺在5µg/mL浓度下对烟草疫霉菌的孢子萌发起到明显的抑制作用，20µg/mL时抑制率为100%；环己酰亚胺能够抑制烟草疫霉菌丝的生长，在燕麦片培养基平板上，4µg/mL和8µg/mL的抑制效果达到84%和98.5%；在盆栽实验中15µg/mL的环己酰亚胺对烟草黑胫病的防治效果为75%。关键词：环己酰亚胺；烟草疫霉；黑胫病；烟草中图分类号：S435.72　　文献标识码：ＡThe Inhibitory Effect of Cycloheximide onPhytophthoranicotianaeXIAZhen-yuan1，KONGGuang-hui1，LEILi-ping1，LIMing-gang2（1.YunnanTobaccoResearchInstitute，Yuxi653100，China；2.YunnanInstituteofMicrobiology，YunnanUniversity，Kunming650091，China）Abstract：TheinhibitoryeffectsofcycloheximideonthegrowthofmyceliumandgerminationofsporesofPhytophathoraparasiticavar．nicotinanaeweremeasuredbybio-determinationinlaboratory．Thecontroleffectofcycloheximideontobaccoblackshankwasevaluatedbypotexperiment．TheresultsindicatedthatcycloheximidecouldsuppressthegerminationofPhytophthoranicotianaesporessignificantlywithlowconcentration．Thegerminationofsporeswassuppressedcompletelywith20μg/mLcycloheximide．Theinhibitoryeffectsofcycloheximidewith4μg/mLand8μg/mLcycloheximidemediawere84%and98.5%，respectively．Thecontroleffectof15μg/mLcycloheximideontobaccoblackshankwas75%inpotexperiments．Keywords：Cycloheximide；Phytophthoranicotianae；Blackshank；Tobacco收稿日期：2007–11–27；修回日期：2008–01–27*基金项目：云南省烟草专卖局（公司）科技项目（04A16）作者简介：夏振远，男，内蒙古宁城人，硕士，副研究员，主要从事烟草植保研究。E–mail：[e-mail]环己酰亚胺（cycloheximide）又叫放线酮，最先（Actidione）是于1948年被德国化学家JaredH.Ford分离并鉴定出来的一种戊二酰类化合物［1］。目前，环己酰亚胺在生物技术研究领域有着广泛的应用，环己酰亚胺被用来研究细胞凋亡机制［2~10］，蛋白质的表达［3］，细胞周期研究［4］，病理模型设计［5］，动物学习记忆能力研究［6］还有不少工作集中在环己酰亚胺生成的代谢调控研究方面［7~8］等。另外，环己酰亚胺对多种真菌具有拮抗作用，在农业病害防治方面也得到广泛应用。在我国就有公主岭霉素和农抗101等环己酰亚胺类农用抗生素制剂的生产。据报道采用10%环己酰亚胺片剂150~250倍液防治茶云纹叶枯病［9］。此外，对谷子白发病，水稻恶苗病，水稻粒黑粉病，稻瘟病，苗期稻瘟病，蔬菜立枯病等真菌病害亦有很好的防效［10］。烟草疫霉（Phytophthoraparasiticavar.nicotianae）烟草农业科学18第4卷是导致烟草黑胫病（PhytophthoranicotianaeBradadeHann）的病源，对烟草生产造成巨大的损失。目前主要采用抗病品种、轮作和化学防治控制其为害。本文利用生物测定方法测定了环己酰亚胺对烟草疫霉的抑制作用，为在生产实践中利用环己酰亚胺防治烟草黑胫病提供了理论依据。1　材料与方法1.1　供试药剂以产生活性环己酰亚胺云南链霉菌（Strepto-mycesyunnanensis）YIM41004T为发酵菌株，摇瓶发酵3d后，脱脂棉漏斗过滤除掉菌体，再过0.22µm微孔滤膜，对滤液进行HPLC定量测量环己酰亚胺浓度，无菌水适当稀释到所需浓度。1.2　供试菌种烟草疫霉（Phytophthoraparasiticavar.nicotianae）菌株分离自发病烟株茎部。采用燕麦片培养基（CA）平板进行培养5~7d，切取φ＝0.5cm的菌丝块供菌丝生长抑制实验。将生长旺盛的菌丝浸泡在无菌水中12h后放入4℃冰箱30min，以诱导产生游动子，脱脂棉过滤去除菌丝体，用无菌水调孢子浓度至1.0×104个/mL供孢子萌发抑制实验。稻谷灭菌后接种烟草疫霉病菌发酵7d，然后进行无菌水浸泡和不同温度交替诱导游动孢子产生制备成菌谷，供盆栽接种实验。1.3　环己酰亚胺对烟草疫霉菌丝抑制作用测定每培养皿加入10mL燕麦片培养基，加入260µg/mL的环己酰亚胺50µL、150µL、300µL致使每个平板上的环己酰亚胺浓度分别为1.3µg/mL、4µg/mL、8µg/mL，冷却备用。接入一个直径为0.9cm的待测病原菌菌块，25℃培养4d后测量菌块的直径，计算抑制率，测定方法参见参考文献[12]。1.4　环己酰亚胺对烟草疫霉孢子萌发抑制试验将供试药剂附着在载玻片上，然后将烟草疫霉孢子悬浮液滴在上面，保湿、25℃保持18h，镜检并计算孢子萌发率。1.5　环己酰亚胺对烟草疫霉室内盆栽试验供试烤烟品种为红花大金元，设置5个实验处理，A、B、C为环己酰亚胺5µg/mL、10µg/mL、15µg/mL，每株500mL浇施，E为浇施甲霜灵锰锌正常浓度500mL为药剂对照，F是500mL清水空白对照。每处理烟株为20盆，于盆载后10d根胫部接种黑胫病菌谷20粒，覆土后进行药剂及对照处理。在处理后注意土壤湿度，其它栽培管理措施措施按常规措施实施。处理30d后进行烟草黑胫病观察分级，其分级标准参见YC/T39–1996。2　结果与分析   2.1　环己酰亚胺对烟草疫霉菌孢子萌发抑制作用测定从表1测试结果可以看出，环己酰亚胺的确可以很好地抑制烟草疫霉菌孢子的萌发，并且在很低的浓度下就可以产生明显的抑制作用，5µg/mL、10µg/mL、15µg/mL、20µg/mL浓度的环已酰亚胺对烟草疫霉孢子的萌发抑制率分别为93.23%、97.29%、98.92%和100%。2.2　环已酰亚胺对烟草疫霉菌丝生长抑制作用测定结果通过表2的调查数据来看，1.3µg/mL的环己酰亚胺对烟草黑胫病病原菌菌丝的生长抑制作用不理想仅达到31.9%，而4µg/mL和8µg/mL的环己酰亚胺能够很好地抑制黑胫病病原菌菌丝的生长，抑制率分别达到了84%和98.5%。通过图1可以看出环己酰亚胺的抑制效果，其使病原菌菌丝不能匍匐生长，菌丝稀疏，形似气生菌丝状。2.3　环已酰亚胺对烟草黑胫病盆栽药效试验三个浓度供试药剂，化学药剂甲霜灵和空白对照的烟草黑胫病盆栽试验发病情况见表3，从调浓度/µg·mL–1Concentration孢子总数/个Numberofspore萌发数/个Numberofgerminatingspore萌发率/%Germinationrate校正抑制率/%Calibratedinhibitionrate5400256.2593.2310400102.5097.291540041.0098.922040000100清水对照40036992.25–表1　环己酰亚胺抑制烟草疫霉菌孢子萌发抑制作用Tab.1　Inhibitioneffectofcycloheximideonsporegerminationofphytophthoraparasiticavar.nicotianae19第1期药剂浓度/µg·mL–1Concentration菌落生长直径Diameterofmyceliumcolony/cm平均meanvalue抑制率/%Inhibition1234567891011CK3.63.8443.93.643.23.73.43.72–1.33.232.9232.8231.941.11.61.21.51.21.51.358480.90.90.910.91.10.910.90.90.90.94298.5表2　环己酰亚胺对烟草疫霉菌丝生长抑制作用Tab.2　Inhibitioneffectofcycloheximideonmyceliumgrowthofphytophthoraparasiticavar.nicotianae处理/µg·mL–1Treatment病害分级株数numberofdiseasedplantclassification病情指数diseaseindex防治效果/%controlefficiency0123451540011060101711018.7565151810016.2575甲霜灵2000000100CK12310425–表3　环己酰亚胺对烟草黑胫病防治Tab.3　ControleffectofCycloheximideonPhytophthoranicotianae图1　环己酰亚胺对黑胫病病原菌菌丝生长抑制图A放线酮下的菌丝、B受抑制的菌丝生长呈气生状、C对照 Fig.1　InhibitionofCycloheximideonmyceliumgrowthofPhytophthoraparasiticavar.nicotianaeA：ColonyP.nicotianaewith8µg/mLCycloheximide;B：Inhibitedmyceliumshowingtheaerialhyphae;C：CK夏振远，等：环己酰亚胺对烟草疫霉菌的抑制作用测定查数据可以看出5µg/mL、10µg/mL、15µg/mL的环已酰亚胺对烟草黑胫病的防治效果分别为60%、65%、75%，比较化学药剂甲霜灵的防效100%还有一定的差距，因此还需在使用方法和使用浓度等方面进行进一步的实验研究。3　讨论环已酰亚胺是很早被发现的一类抗生素，但由于其成本高以及具有毒性，因此没有在农业领域得到大范围的应用。本项研究应用云南微生物研究所发现的云南链霉菌，经过各种优化产率大大提高［11］，使环已酰亚胺在农业上应用得到可能。本研究测定了环已酰亚胺对烟草疫霉孢子萌发、菌丝生长以及在盆栽烟上抑制烟草黑胫病的效果，在离体的条件下，很小的作用浓度就可以很好地抑制烟草疫霉孢子的萌发，8µg/mL的环已酰亚胺几乎完全抑制烟草疫霉的菌丝生长。在盆栽实验中15µg/mL环已酰亚胺对烟草黑胫病的防效为75%，低于化学农药甲霜灵，这可能与土壤中丰富的微生物的分解作用有关。因此环已酰亚胺在生产上推广应用还需对其剂型、使用方法、在土壤中的降解规律等进行进一步研究。烟草农业科学20第4卷［1］　LEACHBE，FORD，ACTIDIONEJH．AnantibioticfromStreptomycesgriseus［J］．J.Am.Chem.Soc.,1947，69：474．［2］　杜昌升，彭建新