[PPT]_溶血性贫血

溶血性贫血G6PD试验、血红蛋白电泳、Coombs试验、红细胞渗透脆性试验…….什么叫溶血性贫血？各种原因导致红细胞生存时间缩短、破坏增多或加速，骨髓代偿造血功能不足时所发生的一类贫血。病因（一）红细胞内存在缺陷1.遗传性：（1）膜的缺陷：遗传性球形细胞增多症（2）酶的缺乏：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺乏（3）珠蛋白生成障碍：即血红蛋白病①肽链合成量的异常：地中海贫血②肽链质的异常：异常血红蛋白病2.获得性：阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）（二）红细胞外在因素1.免疫性因素：（1）自身免疫性溶血性贫血（AIHA）（2）同种免疫性溶血性贫血：①新生儿溶血症；②血型不合的输血反应2.物理和机械损伤：（1）行军性血红蛋白尿症、人工心脏瓣膜（2）物理损伤：大面积烧伤、放射损害3.化学药物和生物因素：（1）磺胺类、苯类、砷和铅等（2）疟疾、溶血性链球菌、支原体肺炎、蛇毒和毒蕈中毒临床表现（1）急性溶血性贫血：①头痛、呕吐、高热②腰背四肢酸痛，腹痛③酱油色小便④面色苍白与黄疸⑤严重者有周围循环衰竭、少尿、无尿（2）慢性：①贫血；②黄疸；③肝脾肿大如何诊断溶血性贫血？第一步确定是否有溶血第二步哪一类溶贫一、首先确定有溶血1、找出RBC破坏增多的依据（1）RBC寿命测定〈15天（正常半衰期25～32天）（2）血片见RBC碎片（3）血浆游离HB增高（血管内溶血）（4）HB尿检测（＋），酱油色（5）尿含铁血黄素试验（＋）（6）血清非结合胆红素（间接胆红素）增高（7）尿胆原增高（8）血清结合珠蛋白检测均减低2、找出RBC代偿增生的依据（1）网织RBC增多网织RBC有核红细胞（2）外周血见有核RBC（3）骨髓红系统增生明显活跃（4）红细胞形态异常：多染性、Howell-Jolly小体、cabot环、红细胞碎片Howell-Jolly小体cabot环红细胞碎片镰状红细胞球形红细胞脾脏，窦状隙被球形红细胞塞满了靶性红细胞二、哪一类溶血性贫血？常用筛查病因诊断试验（1）红细胞渗透脆性：增加：球形细胞↑减低：地中海贫血（2）Ham试验阳性（PNH）（3）高铁血红蛋白还原试验和G-6-PD酶活性试验：G6PD缺乏症（4）血红蛋白电泳和碱变性试验：地中海贫血（5）异丙醇试验：不稳定血红蛋白病（6）Coombs试验（AIHA）一、红细胞膜缺陷的检验一、红细胞膜缺陷的检验红细胞渗透脆性试验酸溶血试验(Ham)1、红细胞渗透脆性试验原理:是测定红细胞对不同浓度低滲氯化钠溶血的抵抗能力渗透脆性减低渗透脆性增高方法：0.60.40.2NaCl参考值开始溶血：0.42%~0.46%（4.2~4.6g/L）NaCL完全溶血：0.28%~0.34%（2.8~3.4g/L）NaCL临床意义（1）脆性增高遗传性球形红细胞增多症（2）脆性减低小细胞低色素性贫血：海洋性贫血、缺铁性贫血红细胞孵育渗透脆性试验原理37℃孵育24小时，细胞内葡萄糖消耗增加，ATP减少，钠离子泵出减少，细胞膨胀脆性增高。参考值未孵育50%溶血4~4.45%孵育50%溶血4.65~5.9%意义脆性增高遗传性球形红细胞增多症脆性减低缺铁性贫血珠蛋白生成障碍性贫血一、红细胞膜缺陷的检验红细胞渗透脆性试验酸溶血试验(Ham)2、酸溶血试验(Ham)原理：红细胞+弱酸血清（pH6.6~6.8）37℃1小时红细胞膜对补体敏感，备解素作用下溶血。临床意义：正常人阴性，阵发性睡眠性血红蛋白尿阳性（PNH）PNH不同时间尿样含铁血黄素Ham试验二、红细胞内酶缺陷的检验二、红细胞内酶缺陷的检验自身溶血试验及纠正试验高铁血红蛋白还原试验1、自身溶血试验及纠正试验原理：细胞内酶缺陷（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G-6PD）(丙酮酸激酶)，葡萄糖效解障碍，不能提供足量ATP，红细胞在自身血浆中温育48小时，不能继续从血浆摄取葡萄糖作能量来源，ATP减少，不能维持红细胞内钠泵作用，导致溶血增加。在温育过程中分别加入葡萄糖和ATP作纠正物，看溶血能否纠正。参考值：正常人轻微溶血，溶血度3.5%；加葡萄糖、ATP溶血明显纠正，溶血度1%。临床意义：（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G-6PD缺乏症蚕豆病）溶血增加，加葡萄糖、ATP溶血部分纠正，（丙酮酸激酶缺乏症）加葡萄糖不能纠正。加入ATP能纠正。二、红细胞内酶缺陷的检验自身溶血试验及纠正试验高铁血红蛋白还原试验2、高铁血红蛋白还原试验原理：正常血红蛋白是亚铁血红蛋白，可被亚硝酸氧化为高铁血红蛋白。当红细胞内葡萄糖-6-磷酸脱氢-6-磷酸脱氢酶含量正常时，通过戊糖循环形成的还原型辅酶Ⅱ可作为血液中高铁血红蛋白还原酶的辅酶，并在递氢体美蓝的参与下，使形成的高铁血红蛋白还原为亚铁血红蛋白。当红细胞内缺少葡萄糖-6-磷酸脱氢-6-磷酸脱氢酶时，则高铁血红蛋白不能被还原。高铁血红蛋白为褐色，在630～650nm波长处吸光度最高，故可加以测定。参考值：定性：阴性。定量：还原率＞75%。临床意义：（1）阳性：葡萄糖-6-磷酸脱氢-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺乏症、纯合子型、中间反应为杂合子型。（2）定量＜30%：G-6-PD缺乏症纯合子型。（3）定量74%～31%：G-6-PD缺乏症杂合子型注意事项：（1）受检者红细胞比容对结果有一定影响，比容低于30%时，高铁血红蛋白还原率可明显降低故贫血患者应先调整红细胞比容后再测定。（2）抗凝剂以38g/L柠檬酸钠或输血时用的抗凝剂ACD为好，血液标本可保存1周左右。肝素抗凝也可用（每毫升血液用肝素0.5mg），但标本只能保存3天。草酸盐抗凝不适于本法。（3）ACD抗凝剂量不宜太多，血液与ACD抗凝剂按1∶0.15混合即可，否则可因pH降低，而使高铁血红蛋白还原速度减慢，以致出现假阳性。二、红细胞内酶缺陷的检验G-6-PD荧光斑点法试验G-6-PD活性测定1、G-6-PD荧光斑点试验原理：在葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）和NADP存在下葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）能使NADP还原成NADPH，后者在紫外线照射下会发出荧光参考值：正常人会出现强荧光。G6PD缺乏者的荧光很弱；杂合子或某些G6PD变异体则可能有轻度到中度荧光注意事项：1、此法是直接测定NADPH的量，特异性较好2、每次检测均要做阴阳性对照二、红细胞内酶缺陷的检验G-6-PD荧光斑点法试验G-6-PD活性测定2.1、G-6-PD活性校正值测定原理：G-6-P+NADP+G6PG6-PGA+NADPH+H+6-PGA+NADP+6-PGDR-5-P+NADPH+H++CO2，在340nm处监测NADPH吸光度的升高，计算酶的活性。参考值：G-6-PD6-P-GDG6PD/6PGD成人6.0-14.05.0-14.00.7-1.9儿童6.5-14.75.5-11.50.8-2.0新生儿11.0-24.06.0-12.51.1-2.6脐带血12.0-26.06.5-13.51.2-2.9临床意义：1、G-6-PD、G-6-PD/6-P-GD均偏低见于G-6-PD缺乏症2、G-6-PD偏低、而6-P-GD升高见于G-6-PD重度缺乏合并地中海贫血症3、G-6-PD与6-P-GD均升高多见于单纯性地中海贫血4、G-6-PD正常，6-P-GD均升高多见于G-6-PD杂合子合并地贫或其他增生性贫血患者2.2、G6PD活性简易法测定原理：G-6-P+NADP+G6PG6-PGA+NADPH+H+在340nm处监测NADPH吸光度的升高，计算酶的活性。参考值：健康成年人，红细胞G6PD活性为8-18U/gHb临床意义：红细胞G-6-PD催化反应生成的NADPH是谷胱甘肽还原酶的辅酶，还原性谷胱甘肽（GSH）是保持血红蛋白稳定性及红细胞膜完整性的必要条件。红细胞G6PD缺乏者，在服用某些药物（如抗疟药、砜类药、伯氨喹啉、磺胺药等）及食用蚕豆后，代谢产生自由基，或者氧合血红蛋白作用形成的H2O2，使GSH氧化成GSSG，由于GSH降低，Hb的疏基失去GSH保护，被氧化变性形成Heinz小体。红细胞膜失去疏基保护而功能受损，导致溶血，G6PD基因在X染色体上，通过女性遗传，男性患者居多。G-6-PD缺乏或者减少见于G6PD缺乏症、药物反应、蚕豆病、感染等。治疗措施：对急性溶血者，应祛除诱因。在溶血期应供给足够水分，注意纠正电解质失衡，口服碳酸氢钠，使尿液保持碱性，以防止血红蛋白在肾小管内沉积。贫血较轻者不需要输血，祛除诱因后溶血大多于1周内自行停止。贫血较重时，可输给G-6-PD正常的红细胞1-2次。应密切注意肾功能，如出现肾功能衰竭，应及时采取有效措施。新生儿黄疸可用蓝光治疗，个别严重者应考虑换血疗法，以防止胆红素脑病的发生。抗氧化剂还原型谷胱甘肽可稳定红细胞膜，从而减轻溶血疾病预防：在G-6-PD缺陷高发地区，应进行群体G-6-PD缺乏症的普查;已知为G-6-PD缺乏者应避免进食蚕豆及其制品，忌服有氧化作用的药物，并加强对各种感染的预防。注意事项：1、红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)缺乏症是世界上最多见的红细胞酶病，据统计全球约有近4亿人G-6-PD缺陷。本病常在疟疾高发区、地中海贫血和异常血蛋白病等流行地区出现，地中海沿岸、东南亚、印度、非洲和美洲黑人的发病率较高。我国分布规律呈“南高北低”的态势，长江流域以南，尤以广东、海南、广西、云南、贵州、四川等地为高发区，发生率为4%-15%，个别地区高达40%2、全血标本中G-6-PD比较稳定，但溶血后极不稳定。若不能及时测定，将全血标本保存于4℃，可稳定数天。3、年轻患者如红细胞计数正常，单纯G-6PD活性升高，一般无临床意义。三、血红蛋白异常的检查血红蛋白的组成血红蛋白由血红素与珠蛋白组成血红素：铁原子与原卟啉Ⅸ复合物。珠蛋白：包括α、β、γ、δ、ε和ζ珠蛋白6种。血红蛋是由两种不同的鳌合了血红素的珠蛋白肽链所形成的四聚体结构，在人体的不同发育时期，其主要的血红蛋白（Hb）组成不同。Hb的种类A.正常的Hb分三类a.HbA(α2β2)b.HbF(α2γ2)c.HA2(α2δ2)B.异常Hb有两类a.快速异常Hb:稳定Hbb.慢速异常Hb:不稳定Hb三、血红蛋白异常的检查血红蛋白电泳试验异丙醇试验1、血红蛋白电泳试验原理：各种Hb的主要差异是组成珠蛋白的肽链不同，不同的肽链含有不同的氨基酸，因此具有不同的等电点，在PH的缓冲液中带有不同的电荷。在碱性缓冲液中，Hb带负电荷，反之带正电荷。肽链中一个或几个氨基酸被取代或缺失后，通常所带的电荷也随之发生改变。在电场中，带有不同电荷的珠蛋白分子分别向正极或负极移动，其迁移速度和带电荷的强弱相关。常见血红蛋白电泳方法1、醋酸纤维膜电泳2、琼脂糖凝胶电泳3、全自动Hb电泳仪醋酸纤维膜电泳→主要过程←琼脂凝胶电泳↓RBC洗涤↓制备溶血↓点样↓电泳↓染色与脱色↙↘扫描法↙比色法:分区剪下色带，洗脱分区切割色带,融化琼脂，干燥,透明→比色血红蛋白电泳设备▊▋▋▉▋▋▋HJKAGDE点样线→正常→▉▍▋▋AFA2CA常见血红蛋白电泳方法1、醋酸纤维膜电泳2、琼脂糖凝胶电泳3、全自动Hb电泳仪全自动Hb电泳仪目前国内使用的主要有美国的Helena电泳仪、扫描仪和分析系统。法国的Sebia电泳仪、扫描仪和分析系统。国产的金桑特电泳仪、扫描仪和分析系统。1.通过扫描定量给出HbA、HbA2和HbF值。2.异常区带通过查表确定。毛细管电泳分离的血红蛋白定性区域Z15:HbHZ14://Z13:Hb-JRovigo,HbN-BaltimoreZ12:HbBart’s,HbJ-Providence,HbJ-Mexico,HbJ-baltimore….Z11:DenaturatedHbA,HbKaoshiungZ10:HbHope,HbM-IwateZ9:HbA,HbCamperdown,HbPhnomPenh……Z8:AcetylatedHbF,HbAltanta,HbAthens-GAZ7:HbF,denaturatedHbS,HbP