第三章 培养基及其配制

第三章培养基本章的教学目标熟悉培养基的组成成分及其作用了解培养基的基本类型及其特点掌握培养基的配制、保存方法。本章的主要内容培养基的成分培养基的类型及特点培养基的筛选、配制和保存培养基的概念培养基（medium）是外植体生长的物质基础，它的组成对离体的植物器官和组织的生长起着重要作用。没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。MS+6-BA1.0mg/L+2,4-D0.6mg/L，MS+6-BA2.0mg/L+2,4-D0.3mg/L。MS+6-BA3.0mg/L+2,4-D0.2mg/L。MS+6-BA2.0mg/L+2,4-D0.1mg/L。一、培养基的主要成分无机营养成分有机营养成分植物生长调节物质附加物和天然的有机添加物质琼脂pH值无机营养又叫矿质营养，指植物在生长发育时所需要的各种维持其正常生理活动的化学元素。主要有：大量元素：微量元素：（一）无机营养成分＞0.5mmol／L＜0.5mmol／LN：作用：是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分形式：NO3—N和NH4—NP：作用：是磷脂的主要成分。形式：KH2P04或NaH2P04K：作用：对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。形式：KCI、KN03等盐类Mg、S作用：Mg是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S是含S氨基酸和蛋白质的组成成分。形式：MgSO4·7H20Ca：作用：Ca是构成细胞壁的一种成分，对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用形式：CaCl2·2H2O。1.大量元素：主要元素：Fe、B、Mn、Cu、Mo、Co等。Fe:作用：是某些酶的组成成分：氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。形式：FeSO4·7H20和Na2—EDTA思考：为何不用Fe2（SO4）3，和FeCl3？B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长、发育异常现象。2.微量元素：（二）有机营养成分碳源维生素肌醇（环己六醇）氨基酸种类：最常用：蔗糖葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持许多组织很好的生长。作用：糖作为碳源，为细胞提供合成新化合物的碳骨架为细胞的呼吸代谢提供底物与能源同时维持一定的渗透势，并且能够维持一定的渗透压（一般在1.5～4.1×10５Pa）。浓度：在2%—3%，常用3%。高压灭菌时，一部分糖会发生分解，制定配方时要给予考虑。在大规模生产时，可用食用的绵白糖代替。1、碳源蔗糖（0%）蔗糖含量（1%）蔗糖含量（5%）外植体完全被绿色的芽所包裹，根生长在其下表面在外植体上既没有芽发生，也没有根和愈伤组织产生在外植体上表面边缘产生芽，也有一些根发生芽从外植体的上表面发生而根从下表面发生tissuecultureintheAfricanViolet（非洲紫罗兰）主要作用：是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。主要种类：VBl(盐酸硫胺素)：愈伤组织的产生和生活力有重要作用VB6(盐酸吡哆醇)：能促进根的生长Vpp(烟酸)：植物代谢和胚的发育有一定关系Vc（抗坏血酸）：有防止组织变褐的作用生物素、叶酸、VB12等。一般用量为0.1—1.0mg／L。2、维生素3、肌醇（环己六醇）作用：在糖类的相互转化中起重要作用。适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。使用浓度一般为l00mg／L作用：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。丝氨酸和谷氨酰胺有利于花药胚状体或不定芽的分化。甘氨酸能促进离体根的生长，对植物组织培养物的生长也有良好的促进效果。种类：最常用：Gly其他：如Arg、Glu，Gln、Asp、Asn、Ala等也常用。用量为2～3mg/L4、氨基酸生长素类(auxin)（三）、植物生长调节物质细胞分裂素类赤霉素类生长抑制剂类1、生长素类(auxin)：作用：主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。浓度：0.05－5mg／L。种类：IAA：天然存在的生长素，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小、，高温高压易被破坏，也易被细胞中的1AA分解酶降解，受光也易分解。NAA：耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。IBA：促进发根能力较强的生长调节物质。NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。2，4—D：起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。强弱顺顺序为：2,4-D＞NAA＞IBA＞IAA溶于95％酒精或0.1mol/L的NaOH种类：是腺嘌吟的衍生物6－BA：常用KT(kinetin）:激动素ZT(zeatin玉米素)：活性最强生理作用的强弱顺序：ZT＞6-BA＞KT。浓度：0.05－10mg／L。作用：诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。促进细胞分裂与扩大。抑制根的分化。2、细胞分裂素类生长素/细胞分裂素比例两种激素配比模式有利于根芽的分化有利于芽的形成有利于根的形成和愈伤组织的形成；高低适中NoBAP（苄氨基嘌呤）BAPreducedto0.1mg.L-1NoNAAPoorshootdevelopmentandnoroots.ExtensivecallusgenerationPoorshootdevelopmentandnorootsNAAreducedto0.1mg.L-1Morebalanceddevelopmentofrootsandshoots.However,undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplantProfusedevelopmentofrootsandareducednumberofshoots.UndifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplantNAAincreasedto5.0mg.l-1Profusedevelopmentofrootsovertheexplantupperandlowersurface,andfewshoots.SomecallusNosignofregenerationfromexplantatall.SomerootgrowthbutreduceddevelopmentofshootsShootsdevelopedonuppersurfaceofexplant.Norootsorcallus.NoMSsaltsMSsaltsreducedto0.47g.l-1MSsaltsincreasedto9.52g.l-1作用：有20多种，生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同。培养基中添加的是GA3，主要作用是促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株；赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。赤霉素和生长素协同作用：对形成层的分化有影响当生长素／赤霉素比值高时有利于木质部分化比值低时有利于韧皮部分化；3、GA(赤霉素)：4、生长抑制剂类作用：适当种类和数量的生长抑制剂能调节内源和外源的植物激素，是他们所处的相互关系恰好能产生我们所希望的变化。种类：ABA三碘苯甲酸：可以促进秋海棠叶片形成芽（Heide,1971）。矮壮素比久（B9）根皮苷：在培养基中加入适当的根皮苷可提高莲叶秋海棠、雪松和月季的分化出苗效率（李洲，1983）用量为1~7mg/L。间苯三酚（四）附加物和天然的有机添加物质天然的有机添加物质附加物活性炭、Vc等抗生物质常用的有:椰乳：香蕉：水解酪蛋白：作用：对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。注意：其成分大多不清楚，所以一般应尽量避免使用。1、天然的有机附加物：应用：茎尖初代培养，可以吸附外植体产生的致死性褐化物，一般为0.1%—0.2%，不能超过0.2%。活性炭在生根时有明显的促进作用，可能是通过减弱光照保护IAA。降低玻璃苗的产生频率，对防止产生玻璃苗有良好作用，一般浓度为0.3%。活性炭在胚胎培养中也有一定作用，如在葡萄胚珠培养时向培养基加入0.1%的活性炭，可减少组织变褐和培养基变色，产生较少的愈伤组织。作用：活性炭结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质。浓度:0.5—l0g／L。2.活性炭注意：研究表示，每毫克的活性炭能吸附l00ng左右的生长调节物质大量的活性炭加入会削弱琼脂的凝固能力，因此要多加一些琼脂。很细的活性炭也易沉淀，通常在琼脂凝固之前，要轻轻摇动培养瓶。种类：青霉素、链霉素、庆大霉素等浓度：5—20mg/L作用：可防止菌类污染，减少培养中材料的损失。对于刚感染的组织材料，可向培养基中注入5%—10%的抗菌素。3.抗生物质特性：琼脂(agar)是固体培养基的必要成分琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40℃即凝固为固体状凝胶。用量：琼脂条6—10g／L，琼脂粉3—4g／L。（五）、琼脂（六）pH培养的植物材料大多数要求弱酸性的环境一般应将培养基的pH值用1mol/L的K0H或NaOH调整到pH5.6～5.8的范围内，有时调到pH6.0少数喜酸性的植物有用到pH5.4，甚至pH4.6的。二、培养基的类型及特点（一）培养基的类型基本培养基（根据培养基中无机盐含量的不同）含盐量高的培养基如:MS,LS,BL,BM,ER硝酸钾含量高的培养基如:B5,N6,SH中等无机盐含量培养基如:H,Nitsch,Miller低无机盐培养基如:White,WS,HB应用培养基诱导培养基，又称脱分化培养基。用作外植体诱导发生愈伤组织的培养基继代培养基：诱导出的愈伤组织需用一种培养基让它继续不断地生长下去。分化培养基：用于从愈伤组织诱导形成小苗（幼芽或胚状体）的，称为。生根培养基:为诱导再生小苗生根的培养基称为。类型种类特点适应范围MS及其类似培养基MS(MurashigeandSkoog,1962)无机盐成分含量较高，微量元素种类较全，浓度也较高应用最广，对许多植物均是适宜的LS(Linsmainer和Skoog,1965)由MS改进，无机成分同MS，有机物仅保留盐酸硫胺素0.4mg/L及肌醇100mg/L，蔗糖3%BL（Brown和Lawrene,1968）成分与MS类似BM(Button,1975)成分与MS类似，仅将盐酸硫胺素除去，蔗糖为3%ER(Eriksson,1965)成分与MS类似硝酸盐含量较高的培养基B5(Camborg等，1965)含有较高的硝酸盐和盐酸硫胺素，较低的铵态氮N6（朱至清等，1975）广泛应用于花药培养SH(Scken和Hildebrandt,1972)矿质盐浓度较高，其中铵与磷酸是由NH4H2PO4提供的中等无机盐含量的培养基H(Bourgin和Nitsch,1967)大量元素是MS的一半，微量元素种类减少而浓度较MS高，维生素种类较MS多Nitsch(1969)与H成分基本相同，仅生物素较H高10倍Miller(1963)和Blaydes(1966)二者成分完全相同，与MS比较，无机元素减少1/3~1/2，微量元素种类减少，无肌醇低无机盐培养基White(WH)无机盐种类及用量均少于MS，约为MS的1/3WS(Wolter和Skoog,1966)适于生根培养HE(Heller,1953