第五章 分子生物学研究法--DNA、RNA及蛋白质操作技术 - 副本

第五章分子生物学研究法(上)——DNA、RNA及蛋白质操作技术内容提要：•重组DNA技术回顾•DNA基本操作技术•RNA基本操作技术•SNP的理论与应用•基因克隆技术•蛋白质组与蛋白质组学技术基因操作主要包括：•DNA分子的切割与连接；•核酸分子杂交；•凝胶电泳；•细胞转化；•核酸序列分析以及基因人工合成；•定点突变和PCR扩增等。基因工程：指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。基因工程技术强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。5.1重组DNA技术回顾三大成就：①在20世纪40年代Avery确定了基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；②50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和世代交替问题；③50年代末至60年代，提出了“中心法则”和操纵子学说，阐明了遗传信息的流动与表达机制。重组DNA技术史上的主要事件（GMO转基因生物）2003美国科学家完成狗基因组全序列测定2004中国科学家完成家蚕基因组全序列测定2005中、美、日科学家联合完成水稻基因组序列测定2005美、德、日、意、以科学家完成黑猩猩基因组全序列测定限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。双酶切在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体（vector）。如：病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种分子后，将其重新导入到寄主细胞中，通过细菌（如：大肠杆菌）转化，选择转化子，通过筛选，获得DNA重组表达。并可在宿主细胞中保持下来，也可以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。重组DNA操作过程：重组DNA实验中常见的主要工具酶5.2DNA操作技术核酸的凝胶电泳自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及研究蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。琼脂糖是从琼脂中提纯到的。它由β-D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖交替结合形成的线性多聚糖。利用琼脂糖热溶液冷却时能凝胶化的特点，采用不同浓度的琼脂糖溶液，成球后可得到不同孔径的球状凝胶，用于分离核苷酸类化合物。凝胶电泳的基本原理：•一种分子被放置到电场中，就会以一定的速度移向适当的电极。把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率。•电泳迁移率与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。•生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所以，DNA和RNA又被称为多聚阴离子，在电场中向正极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此都能以同样的速度向正电极方向迁移。•琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间。•聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。•凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。在凝胶电泳中，加入溴化乙锭（ethidiumbromide，EtBr）染料对核酸分子进行染色，然后放置在紫外光下观察，可灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05μg的微量，也可以被清晰地检测出来。EB（Ethidiumbromide，溴化乙锭），分子式：C21H20BrN3，熔点：260-262°C，是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA。溴化乙锭用标准302nm紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号，可用Polaroid底片或带CCD成像头的凝胶成像处理系统拍摄。溴化乙锭可以嵌入碱基分子中,导致错配。溴化乙锭是强诱变剂,具有高致癌性!EB可以被皮肤吸收。做实验时一定要带手套。1严禁随便丢弃。因为EB是强致癌性，而且易挥发，挥发至空气中，危害很大。2废EB溶液的处理方法(1)对于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下处理：a.将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/ml；b.加入一倍体积的0.5mol/LKMnO4，混匀，再加入等量的25mol/LHCl，混匀，置室温数小时；c.加入一倍体积的2.5mol/LNaOH，混匀并废弃。(2)EB含量小于0.5mg/ml的溶液可如下处理：a.按1mg/ml的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放置1小时；b.用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。3废EB接触物，如抹布，枪头。一般回收至黑色的玻璃瓶中，定期进行焚烧处理。分离超大片段的DNA5.2.2细菌转化与目标DNA分子的增殖细菌转化：一种细菌菌株由于捕获了另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。•提供转化DNA的菌株叫作供体菌株；•接受转化DNA的细菌菌株称为受体菌株。大多数细菌，正常条件下转化效率很低。为了高效转化这些细菌，必需对受体细菌进行一些理化处理，以增加它们获取DNA的能力。经历了这种处理的细胞被称作感受态细胞（competentcells）。细菌转化常用的方法：CaCl2法和电击法CaCl2法：将快速生长中的大肠杆菌置于经0℃预处理的低渗CaCl2溶液中，使细胞膨胀形成原生质球，与外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。42℃下做短暂热刺激，复合物便会被细胞所吸收。在培养基中生长一段时间使转化基因实现表达，就可涂布于选择性培养基中分离转化子。电击法是细菌转化的另一种高效法：由于转化载体上一般带有LacZ基因（大肠杆菌编码β-半乳糖基酶），实验室常用带有不同抗生素的选择性培养基结合α-互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。感受态细胞转化频率的计算方法为：•转化体总数=菌落数×（转化反应原液总体积/涂板菌液体积）•插入频率=白色菌落数/(白色菌落数+蓝色菌落数）•转化频率（每μgDNA转化菌落数）=转化体总数/加入质粒DNA总量(μg）。λ噬菌体作为克隆载体构建基因文库流程图细菌转化及蓝白斑筛选蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法：含空载体的菌落为蓝斑；含外源DNA的菌落为白斑；未转化的细菌不能在抗性培养基上生长。5.2.3聚合酶链反应技术聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)是1985年问世的一种体外扩增DNA片段的技术。首先将双链DNA分子加热分离成两条单链，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种dNTP合成新生的DNA互补链。因为DNA聚合酶需要有一小段双链DNA来启动（“引导”）新链的合成，所以，新生DNA链的起点由一小段寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火位点所决定。PCR反应的全过程，即三步，可以被不断重复：•DNA解链（变性），•引物与模板相结合（退火），•DNA合成（链的延伸）。经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是2n。PCR的主要步骤将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温（94℃）环境下加热1分钟，使双链DNA变性，形成单链模板DNA。然后降低反应温度（约50℃），致冷1分钟，使寡核苷酸引物与两条单链模板DNA发生退火作用并结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上。最后，将反应混合物的温度上升到72度左右保温1-数分钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3'-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按5'→3'方向延伸，合成新生DNA互补链。变变变变变变90变95变40变60变70变75变PCR的基本原理变性、复性、半保留复制PCR三步曲变性90～97℃退火45～55℃延伸72℃左右PCR指数扩增时循环次数与DNA产物数量的比较。PCR的基本原理DNA模板DNA引物dNTPTaqDNA聚合酶1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数PCR引物设计①一对引物，与3′端互补②长度：15～30个核苷酸③碱基分布随机④引物内、引物间不应有互补序列⑤引物与非特异扩增区无同源性⑥3′端必须互补⑦5′端可游离5.2.4实时定量PCR（Real-timeQuantitativePCR）实时定量PCR是20世纪90年代中期发展起来的基于PCR技术的利用不同的荧光检测来给核酸定量的技术。具备了传统PCR的优点，又克服了传统PCR的许多缺点。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念——Ct值。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。实时定量PCR反应在带透明盖的塑料小管中进行，激发光可以直接透过管盖，使其中的荧光探针被激发。荧光探针事先混合在PCR反应液中，只有与DNA结合后，才能被激发出荧光。例如，荧光染料SYBRGreenⅠ，激发光波长520nm，这种荧光染料只能与双链DNA结合，并且只有在与DNA结合时，才能被激发产生荧光。荧光染料SYBRGreenⅠ探针的实时定量PCR利用荧光染料SYBRGreenⅠ可以检测PCR反应中获得的全部双链DNA，但不能区分不同的双链DNA。为了进一步确保荧光检测确实是靶DNA序列，人们又设计了只能与目的DNA序列特异结合的荧光探针，如TaqMan探针。这种探针是一小段被设计成可以与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA（50-150bp）。随着PCR反应进行，这种探针结合到目的DNA序列上，并且会被具有外切酶活性的TaqDNA聚合酶逐个切除而降解。被切下的荧光基团会在激发光下发出荧光，荧光强度直接反映了扩增靶DNA的总量。应用TaqMan探针实时定量PCR技术5.25基因组DNA文库构建把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体结合，导入微生物细胞，形成克隆。汇集包含基因组中所有DNA序列的克隆（理论上每个序列至少有一份代表）。这样的克隆片段的总汇，称为基因组DNA文库。定义：指将某生物的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度的DNA片段，再与适合的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。代表性是指文库中所