72010年版药典一部生物安全性检查和生物活

2010年版药典一部生物安全性检查和生物活性测定法介绍张德波成都市食品药品检测心(成都市药检所)2010年版药典一部安全性检查内容介绍•凡例动物试验(四十五)•成方制剂和单味制剂四个品种•附录ⅩⅢ•ⅩⅢA热原检查法•ⅩⅢD细菌内毒素检查法•ⅩⅢE异常毒性检查法*•ⅩⅢG过敏试验检查法*•ⅩⅢH溶血与凝聚试验*•附录ⅩⅧB中药注射剂安全性检查法指导原则•附录ⅩⅧC中药生物活性测定指导原则凡例--动物试验2005年版一部•动物品系、年龄、性别应符合规定。•尽量取代动物试验，减少动物使用量。2010年版一部•动物应健康。•动物品系、年龄、性别、体重应符合规定。凡例--动物试验实验动物的要求•应是取得实验动物生产资质的单位生产,动物应有合格证。•动物应品系、年龄明确。•动物性别、体重应符合试验需要。•应有严格检疫制度。•使用前应正常饲养至适应使用环境。•应有动物处理制度。成方制剂和单味制剂•止喘灵注射液异常毒性•注射用双黄连（冻干）溶血与凝聚、热原•清开灵注射液异常毒性、热原、溶血与凝聚•注射用灯盏花素*热原、过敏试验、降压物质、异常毒性、溶血与凝聚附录ⅩⅢA热原检查法•热原（Pyrogen）：系指某些药品中含有的能引起体温升高的杂质。•来源：临床上能够引起发热的物质如细菌内毒素、病毒、细菌，以及其他一些微生物、类固醇等。•存在：无所不在，水、灰尘、生产药品的器皿中都存在热原质。•性质：细菌内毒素是细菌细胞壁的一种化学成份，主要为脂多糖，致热性极强，具有耐热、耐酸碱、耐氧化剂，不易破坏，同时具有水溶性、不挥发性、滤过性，在药品生产过程中不易去除。•不良反应：引起人体发冷、寒颤，然后引起发热，甚至昏迷和休克。附录ⅩⅢA热原检查法2005年版药典•供试用家兔•体重1.7～3.0kg,雌者应无孕。•饲养：预测前7日的规定。•淘汰：饲养不正常者供试品判为不合格者使用超过10次者2010年版药典•供试用家兔•体重1.7kg以上,雌者应无孕。•饲养：预测前7日的规定。•淘汰：饲养不正常者供试品判为不合格者•不同点：体重无上限•使用次数不再规定10次•建议：附录ⅩⅢA热原检查法家兔预选•未曾使用过的家兔。•供试品合格，但升温≥0.6℃，休息达2周以上。•3周内未曾使用的家兔。•预选条件应与正式实验一致。•休温应在38.0～39.6℃。•每一只8次测温最高与最低温差应不大于0.4℃附录ⅩⅢA热原检查法2005年版药典试验环境条件•实验室与饲养室温差不得大于5℃，且在17～25℃之间。•实验过程中温度变化≤3℃2010年版药典试验环境条件•实验室与饲养室温差不得大于3℃，且在17～25℃之间。•实验过程中温度变化≤3℃附录ⅩⅢA热原检查法实验操作过程•试验前准备工作:实验兔、相关器具除热原、供试品•正式实验家兔正常体温测定:体温38.0～39.6℃,且两次相差≤0.2℃。供试品液准备:注射前配制，温热至约38℃。分组：三只家兔温度最好相近，组内温差不得过1℃注射给药：15分钟内注射完毕，注意止血。测定给药后的体温•计算体温变化（升温为负值时以0计，注意数值修约）•数值修约：四舍六入五成双12.1498≈12.1;12.16≈12.212.150001≈12.2;12.15≈12.2;12.45≈12.4•得出结论附录ⅩⅢA热原检查法结果判断（2005版）•初试合格•3只均≤0.6℃,且总和≤1.4℃•需复试•3只中有一只≥0.6℃,或均不超过0.6℃，但总和≥1.4℃•初试不合格•3只中≥0.6℃的超过一只。•复试合格•5只中≥0.6℃不超过一只，或8只总和≤3.5℃•复试不合格•5只中≥0.6℃超过一只，或8只总和＞3.5℃结果判断（2010版）•初试合格•3只均≤0.6℃,且总和≤1.3℃•需复试•3只中有一只≥0.6℃,或总和≥1.3℃•初试不合格•3只中≥0.6℃的超过一只•复试合格•5只中≥0.6℃不超过一只，或8只总和≤3.5℃•复试不合格•5只中≥0.6℃超过一只，或8只总和＞3.5℃附录ⅩⅢA热原检查法家兔的重复使用•供试品合格的家兔至少休息48小时。•升温≥0.6℃的家兔，至少休息2周以上，且通过预选合格。•供试品不合格的家兔淘汰•建议：关于升温的家兔关于降温的家兔附录ⅩⅢE异常毒性检查法异常毒性检查•初试动物要求：17~20g，5只。•复试动物要求：18~19g，10只。•给药时间：各论下有规定者按各论项下规定时间，否则按每只4～5秒。•结果观察：给药后观察48小时。•结果判断：以动物是否死亡作为判定指标。附录ⅩⅢF降压物质检查法降压物质检查法对照品贮备液的配制：①磷酸组胺折算成组胺的系数0.342。②规定配制成1.0mg/ml，但最好采用定容方法。③4～8℃保存3个月内使用。将有沉淀析出改为经验证活性符合要求，验证方法：猫注射0.1μg/kg，血压下降均值应不小于2.67kpa。对照品稀释液的配制：配制浓度应根据供试品给药剂量（体积）来确定。实验前的准备工作：对照品、猫、仪器、试验通路联接、手术器具、麻醉剂、供试品猫的麻醉及手术注意事项猫灵敏度测定：0.05μg/kg、0.1μg/kg、0.15μg/kg供试品降压物质检查：dsdTdTds异常情况的处理:动物呼吸困难、动物有苏醒迹象、血压突然下降附录ⅩⅢG过敏试验检查法过敏物质检查法•动物要求:250～350g，雌者应无孕，6只。•致敏：腹腔注射给药0.5ml/只，间日一次，连续3次。•激发：首次致敏注射后的第14日和第21日，静脉注射1ml/只。•结果观察：激发后观察30分钟。建议观察60分钟。•结果判断：如有一只动物出现竖毛、发抖、干呕、连续喷嚏3声、紫癜和呼吸困难等现象中的2种或2种以上，或出现二便失禁、步态不稳或倒地、抽搐、休克，死亡现象之一者，判定供试品不符合规定。•保证实验可靠的几点建议：设置空白、适当增加动物数、激发前的观察、饲养问题对该试验的几点思考：实验剂量、实验动物数、观察指标。附录ⅩⅢH溶血与凝聚检查法•2%兔红细胞混悬液配制•操作法•温育:37±0.5℃,3小时。•结果判断•几个问题试验剂量问题，结果判断问题•乳状液型注射液实验观察问题试管编号1样品2样品3颜色4阴性5阳性2%兔红细胞混悬液ml2.52.52.52.50.9%氯化钠溶液ml2.22.24.72.5蒸馏水ml2.5供试品溶液ml0.30.30.3附录ⅩⅢD细菌内毒素检查法•细菌内毒素（Endotoxin）革兰氏阴性细菌细胞壁的组成成分，具有多种生物活性，其化学结构是脂多糖（LPS）。•生物活性致热性、与鲎试剂反应•特点广泛存在、非常稳定、具有疏水性和亲水性的两性分子致热活性的高度不均一性•细菌内毒素标准品参考标准品（国际国家标准品）国家工作标准品•企业工作品附录ⅩⅢD细菌内毒素检查法鲎试剂鲎血液变形细胞裂解物冷冻干燥制备而成规格:0.1ml;0.5ml.灵敏度（λ）对鲎试剂灵敏度的正确理解。•鲎试剂的灵敏度复核细菌内毒素工作标准液的配制：2λ、λ、1/2λ、1/4λ鲎试剂的复溶：按标示规格复溶，不得稀释或浓配。加样操作结果判断附录ⅩⅢD细菌内毒素检查法•灵敏度复核结果•实验成立与否的判断•结果计算方法:λc=anitlg(∑X/4)•X为反应终点的对数（lg)值。•不需要计算的几种情况内毒素浓度（EU/ml)2λλ1/2λ1/4λ反1++--应2++--管3++--号4++--附录ⅩⅢD细菌内毒素检查法•细菌内毒素的常规检查例1：取本品，用细菌内毒素检查用水至少稀释20倍后，依法检查，本品每1ml中含有的内毒素应小于1.25EU。L=1.25EU/mlMVD=CL/λ---20=1×1.25EU/ml/λλ=0.625EU/ml供试品液配制：样品液——稀释10倍——稀释20倍。内毒素工作标准品配制120EU/支，150601-200963。120EU（1支）——1.0ml（120EU/ml)120EU/ml——————0.25EU/ml（4λ）——0.125EU/ml（2λ）供试品阳性对照液内毒素液0.5ml0.25EU/ml——————————————0.125EU/ml（2λ，20倍稀释液）上样品10倍稀释液0.5ml•例2：某样品规格1g细菌内毒素取本品，依法检查，每1mg中含内毒素量应小于0.1EU•介绍一种简便的操作方法中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草静脉用注射剂热原、异常毒性、溶血与凝聚、过敏反应、降压物质（非降压药）。可考查建立细菌内毒素检查法。肌肉用注射剂异常毒性、过敏反应。中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草热原标准起草•剂量设定：临床成人1小时内最大用量的3～5倍。考虑几点:毒性、干扰、药物本身具有解热性问题。•供试液浓度确定：考虑两点:溶血、刺激性。•注射体积确定：•标准文字表述：异常毒性标准起草•剂量设定：应低于最低致死量，1/3LD1或者1/4LD50。•建议：最好低于明显出现药物本身毒性的剂量。•根据临床用药量来确定。•标准文字表述：中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草降压物质检查标准起草•本身为降压药物不用设置降压物质检查标准。•剂量设定：指导原则定得太宽，操作性很强。无降压作用的药品：临床单次用量的1/5~5倍；有一定降压作用的药品：最大无降压反应的1/4~1/2。供试品临床原液注射1ml/kg无降压反应，可以此作剂量。建议：按临床用量来设定，考虑毒性问题。供试液浓度确定：溶血、刺激性。给药体积确定：标准文字表述：中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草过敏反应标准起草•豚鼠毒性试验•剂量设定：在考虑毒性的基础上，剂量应尽可能大，同时考虑临床用量。致敏次数及激发时间：应当作研究，而不是完全按试验方法规定次数与时间来操作。中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草溶血与凝聚标准起草•实验方法问题：取样量、供试液。•结果判断问题：振摇引起的争议。•个人提出的修改方法建议以此作为内控标准。•供试液配制•试验剂量•结果观察•结果判断中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草细菌内毒素检查标准起草举例：某中药注射液[用法与用量]静脉滴注：一日20～40ml，以10%葡萄糖注射液200ml或氯化钠注射液100ml稀释后使用。（一）内毒素限值确定：L=K/M5EU/（kg.h)=————————=7.5EU/ml40ml/60kg.h需要考虑的因素：5EU/（kg.h)只是理论数值，以此给家兔，有一半体温上升；临床联合用药；注射器、输液器含内毒素，人体内含有的内毒素。最后可以确定内毒素限值为L=4EU/ml。*体表面积给药的计算：中国人体表面积按1.62m2计算。比如：某药临床人用量为100mg/m2则100mg/m2×1.62m2=162mg162mg/60kg=2.7mg/kg中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草细菌内毒素检查标准起草（二）预试验供试液配制成一系列浓度：可采用对倍稀释法。原液、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍稀释液鲎试剂（TAL）灵敏度为λ细菌内毒素工作标准品液配制：2λ浓度加样试验编号原液2倍4倍8倍16倍32倍64倍128倍2λ内毒素○○○○○○○○○○○○○○○○BET水○○○○○○○○○○○○○○○○中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草细菌内毒素检查标准起草预试验结果编号原液2倍4倍8倍16倍32倍64倍128倍2λ内毒素○○○○○○○○○○○○○○○○BET水○○○○○○○○○○○○○○○○（三）正式实验比如预试验稀释16倍就可能没有干扰作用。鲎试剂确定λ=0.25EU/ml细菌内毒素液配制：2λ、λ、1/2λ、1/4λ四个浓度加样操作中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草供试液组内毒素0.50.250.1250.0625○○○○○○○○○○○○○○○○阴性对照○○•BET水组内毒素0.50.250.1250.0625○○○○○○○○○○○○○○○○阴性对照○○中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草细菌内毒素检查标准起草正式实验结论：（四）标准起草供试液:PH最好在6~8,标准规定用缓冲液或酸碱来调节PH