第九章 细菌的培养与分离技术2013

第九章细菌的培养与分离技术细菌培养是微生物学研究和实践的重要技术。以此可培养、鉴定和利用细菌。细菌的培养细菌的分离技术菌落第一节培养基一、培养基的种类和选择培养基（culturemedium）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。一、培养基的主要成分及其作用（一）营养物质1.蛋白胨--氮源2.肉浸液及牛肉膏--氮源和碳源3.糖（醇）类--碳源，鉴别细菌4.血液--辅酶、血红蛋白，鉴别细菌5.鸡蛋与动物血清--特殊培养基6.无机盐类7.生长因子（二）水分不含杂质的蒸馏水或离子交换水（三）凝固物质最合适的凝固剂是琼脂100℃融化，45℃以下凝固。（四）抑制剂---选择性培养基（五）指示剂---鉴别培养基二、培养基的分类按性状分为：固体培养基（琼脂1.5—2.0%）半固体培养基（琼脂0.3—0.5%）液体培养基（无琼脂）分类：按用途分为：基础培养基（肉汤、普通琼脂平板）营养培养基（血平板、巧克力平板）鉴别培养基（KIA、MIU培养基）选择培养基（SS、高盐甘露醇平板）增菌培养基（葡萄糖肉汤）特殊培养基（厌氧培养基……）1．基础培养基含有基础生长所需的基本营养成分，最常用的是肉浸液，俗称肉汤（broth），主要成分含牛肉浸液和蛋白胨。2．营养培养基（nutrientmedium）最常用的是血琼脂平板、巧克力血平板等3．鉴别培养基（diferentialmedium）糖发酵管、克氏双糖铁琼脂（KIA）、伊红-镁蓝琼脂和动力-吲哚-尿素（MIU）培养基等。4．选择培（selectivemedium）SS琼脂使致病的沙门菌、志贺菌容易分离到5．特殊培养基（specialmedium）疱肉培养基、巯基乙醇酸纳培养基培养基的选择根据标本来源和可能存在的病原菌，确定选用各种分离培养基。伊红美蓝/麦康凯用于筛选革兰阴性杆菌。培养基的选择从血液、骨髓中分离病原菌用血液增菌培养基三、培养基的制备（一）玻璃器皿灭菌前的准备（二）培养基制备的一般程序称量－溶化－调整pH值－澄清过滤－高压灭菌－分装－质量检查－保存注意事项：配置培养基必须在玻璃容器中进行；溶解过程中先加水再加干粉；尽量不加热溶解；在室温下测定pH值；分装过程注意无菌操作。步骤：称量：先盐，轻的先称；溶化：先加蒸馏水，再加干粉，搅拌溶解；调整pH值：pH试纸法；澄清过滤：滤纸过滤，纱布加脱脂棉过滤;高压灭菌：121℃15min分装:50℃左右时以无菌操作倾注于灭菌平皿内（内径9cm的平皿约15ml）步骤：质量检查：无菌试验效果试验保存：注明名称、制作日期置于4℃冰箱保存。第二节细菌的人工培养目的：鉴定细菌的种类和保存菌种，为进一步确定细菌的致病性、药物敏感性提供依据。一、无菌技术概念：要点：二、细菌的接种与分离方法（一）接种针和接种环（二）接种罩和无菌室（三）接种与分离技术接种方法：1、平板划线分离法本法可使标本中混杂的多种细菌分散成单个细菌,在培养基表面各自生长繁殖形成单个细菌集团即菌落,以获得纯培养,为进一步鉴定细菌提供条件.平板划线分离法:a.连续划线分离法主要用于杂菌不多的标本分离b.分区划线分离法主要用于杂菌量较多的标本分离接种方法2、斜面接种法主要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性。用接种环（针）挑取单个菌落或培养物，从培养基斜面底部向上划一条直线，然后再从底部沿直线向上曲折连续划线，直至斜面近顶端处止。接种方法3、液体接种法多用于一些液体生化试验管的接种。用接种环挑取单个菌落，倾斜液体培养管，在液面与管壁交界处研磨接种物（以试管直立后液体淹没接种物为准）。接种方法4、穿刺接种法（接种针）主要用于半固体培养基的接种，用于观察细菌的动力。★平行于管壁刺入，刺到离管底约5mm接种针沿原路退出。接种方法5、倾注平板法常用于测定牛乳、水和尿液等标本的细菌数。6、涂布接种法常用于纸片法药物敏感性测定，也用于被检标本中的细菌计数。三、细菌的培养方法根据不同的标本及不同的培养目的，可选用不同的培养方法。通常把细菌的培养方法分为需氧培养、二氧化碳培养、微需氧培养和厌氧培养四种。培养方法★需氧培养法电热恒温培养箱（35℃或37℃）有氧条件下孵育18～24h适用于需氧菌和兼性厌氧菌。培养方法★二氧化碳培养法1）二氧化碳培养箱2）烛缸法3）化学法适用于奈瑟菌属、嗜血杆菌和布鲁菌属等生长时需二氧化碳的细菌的分离培养。培养方法★微需氧培养法用抽气换气法制造微需氧环境：5％O2、10％CO2、85％N2，37℃适用于微需氧菌如空肠弯曲菌、幽门螺杆菌的培养。培养方法★厌氧培养法用理化方法出去密闭容器中的氧，造成无氧环境，以利于专性厌氧菌生长。1）厌氧袋2）厌氧罐3）厌氧手套箱用于分离培养厌氧菌。四、细菌的生长现象★固体培养基（菌落特征）1.菌落的形态特征：大小形状（露滴状、圆形、不规则等）透明度（不透明，半透明、透明）突起或扁平、凹陷边缘（光滑、锯齿状、卷发状等）菌落特征颜色（红色、灰白色、绿色等）表面（光滑、粗糙等）粘度根据细菌菌落表面特征不同分为：光滑型菌落（S型菌落）粗糙型菌落（R型菌落）粘液型菌落（M型菌落）菌落特征2.菌落溶血特征：α溶血（草绿色溶血）β溶血（完全溶血）γ溶血（不溶血）菌落特征3.色素：水溶性色素（铜绿假单孢菌）脂溶性色素（金黄色葡萄球菌）4.气味：生姜气味（铜绿假单孢菌）酵母味（白假丝酵母菌）腐败的恶臭味（厌氧菌）菌落特征3.色素：脂溶性色素水溶性色素（金黄色葡萄球菌）（铜绿假单孢菌）★液体培养基均匀混浊沉淀生长表面生长★半固体培养基---观察细菌动力观察穿刺线是否清晰及培养基的混浊程度。