第三章细胞培养的基本方法

第三章细胞培养的基本方法第一节无菌操作技术第二节培养细胞的观察第三节细胞培养中常用的染色方法第四节细胞培养的污染和检测主要内容教学目的和要求•重点和难点：•掌握细胞培养中无菌操作技术及操作过程中需要注意哪些问题；•预防污染是无菌操作的关键。由于体外培养的细胞没有抗感染能力，因此防污染是决定培养成功的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。一切操作需要保证无菌和有条不紊。组织培养中最重要的，也是最基本的要求就是各项操作均应从无毒害、无污染的培养环境来考虑。培养基、器皿材料、接种工具、操作环境、培养室和超净工作台等各个环节都应注意。第一节无菌操作技术一、实验器具等的洗涤和材料的准备在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。•培养玻璃器具的洗涤是非常重要的。用完后应洗净，再用蒸馏水冲一遍，烘干；•用合适的方法灭菌。二、培养室和超净台的消毒（一）、无菌与有菌范畴灭菌工作是极其重要的。对于初学者来说，首先应建立有菌和无菌的概念。有菌的范畴：凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的。如植物表面、超净工作台的台面，未处理的工具、手等。无菌的范畴：物理或化学处理的物体（工具、器皿、培养基等）健康的动植物不与外部表面接触的组织内部可能是无菌的（有时也有内生菌，但不会影响培养，也不会污染）经过灭菌的物品有可能再次染菌（二）无菌操作室工作前后室内清扫、拖地，以防菌在空气中流动，特别真菌孢子。使用前，室内及超净工作台紫外灯杀菌30分钟，超净工作台酒精（75%）杀菌，工作中一直吹风。三、洗手和着装原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。四、无菌培养操作1、首先点燃酒精灯，所有操作均在火焰近处并经过烧灼进行；冷却后才能使用；2、操作时，打开试管盖，要进行烧灼灭菌，但是时间要短。在火焰上烧瓶口。保证容器倾斜。3、进行操作时动作要准确敏捷，但是不宜太快，防止空气流动，增加污染的机会；•4、超净工作台上的器具和用品要摆放合理；•5、操作时器具不能触及瓶口以防止污染；•6、不要说话、咳嗽、打喷嚏等，头发、首饰等注意；•7、吸管、注射器等专管专用。接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中正确错误整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速正确错误防止操作带来的污染接种过程中尽可能达到悬空要求正确错误正确错误接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口正确错误接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足正确错误接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形态学上端露于空气中正确错误污染材料应及时清除，高压灭菌。菌有两种，细菌成粘液状，真菌有菌丝。特别真菌危害极大。五、使用超净台注意事项•1、超净台安装在清洁无尘的房间内，最好为隔离的无菌间，以免尘土过多易使滤器阻塞，降低净化效果，缩短使用寿命；•2、长期未使用或新安装的超净台使用前必须对工作台和周围环境进行清扫，再采用化学灭菌或紫外线灭菌法进行灭菌处理；•3、使用前用75％酒精擦洗台面，并提前用紫外线灭菌30min。关闭紫外灯后应启动鼓风机运转几分钟后再进行培养操作；•4、净化工作区不应存放不必要的物品，以保持洁净气流型不受干扰；•5、用后工作台要用75％酒精擦洗，以备后面工作人员使用；6、经常注意工作区上方微压表的指示，及时更换滤器。六、培养细胞的取材•取材组织用培养液浸泡，4度运送，24h内尽快培养。•取材无菌操作，避免对组织的机械损伤，尽量去除脂肪、神经、结缔、坏死组织，污染组织可用青链霉素和制霉菌素漂洗。•原代取材同时保留组织学和电镜标本，对供体来源、部位及一般情况做记录。•欲从组织中获得大量生长良好的细胞，须将组织分散开，使细胞解离出来。•常用方法有机械法和化学法。第二节培养细胞的观察组织块培养法•将组织剪成小块后，接种于培养瓶，24小时贴壁后，细胞就从组织周围长出。•培养瓶底预先涂以胶原薄层，以利上皮细胞的生长。•如需做组织染色或电镜检查，可将组织可放入小盖玻片上后再放进培养瓶培养。•换液需轻巧，以免组织块漂起，细胞死亡消化培养法•采用前述的组织消化分散法。将妨碍细胞生长的细胞间质去除，使细胞分散，形成悬液，按不同浓度接种培养瓶培养。密度抑制（Densityinhibition）或接触抑制（Ccontactinhibition）•1958年Abercrombie等学者提出的一种现象，培养细胞再生长过程中多发生分裂增殖，细胞移动而相互靠近，这时某些细胞可移向其他方向，保证细胞不会重叠，一但接触，这种活动即可停止。•所谓接触抑制实际使细胞汇合形成单层时，细胞变得拥挤，与培养液接触的表面区域也相应减少，营养成分消耗，其分裂也将停止。培养细胞的生长过程•1）原代（初代）培养期：从机体取下组织培养到第一次传代，此代细胞保持异质性，细胞种类较多，接近原组织细胞种类。维持时间，因细胞种类不同，一般1-4周。•2）传代期培养：初代培养的细胞生长到一定程度，即可连接传代，使其连续生长。•一般正常二倍体细胞，不加附加条件，可传代30-50代，此时可发生染色体丢失、突变、细胞增殖变慢、停止分裂，进入衰退期，我们称之有限细胞系。这一转折点有人称之危象临界点（crisis）•有些细胞的少数后代，或通过人工条件转化的细胞可通过这一期，获得持久的增殖传代能力，我们称细胞系，或无限细胞系，即一般通称的细胞系。•（3）衰退期：传代细胞到达一定代数，即发生增殖缓慢，逐渐停止，进而发生衰退、死亡，多数传代细胞（或叫有限细胞系），不能通过所谓的“crisis（危象临界点），导致最终死亡，这一现象可能说明生物学衰老的细胞学基础。•人胚胎成纤维细胞可以进行60代增殖，而80岁老人的肺成纤维细胞仅传代了16代后便死亡。表皮细胞寿命4-10天；红细胞3周-3个月，白细胞5-7天，神经细胞数年或更多。实体显微镜（解剖镜）倒置显微镜生物显微镜照相设备对培养材料进行细胞学鉴定和研究2、显微镜观察•3、细胞计数法（cellcounting）用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，以测定细胞增殖和调整细胞浓度的一种方法。•4、细胞生长曲线（cellgrowthcurve）是观察细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标。横坐标为培养时间纵坐标为细胞密度注意：只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合观察。细胞生长曲线020406080100120140135791113151002004008001000细胞数量生长天数缓慢生长期对数生长期平衡期（1）迟缓期（或延迟期）•当细胞接种到培养瓶后，细胞逐渐贴附于瓶底，并恢复贴壁形状，代谢开始旺盛，出现细胞分裂及增殖，但生长缓慢。（2）对数生长期：此期几乎所有的细胞都在进行分裂，细胞数目迅速增长。其细胞倍增时间（TD）等于细胞周期时间（TC）长度。这一期常用细胞倍增时间及细胞分裂指数来判定。（3）平衡期（平坦期）这期细胞数目虽然在增加，但其增加速度在减慢，直至细胞数量不再增加，处于平衡状态。•5、细胞分裂指数指分裂期细胞在全部细胞中所占的百分率，用以表示细胞的增殖旺盛程度。一般要计算和观察1000个细胞中的细胞分裂相数。•6、细胞贴壁率细胞贴壁率又称接种存活率，用于观察贴壁附着生长细胞，主要反映细胞的生存能力和部分底物材料的相容性。•7、细胞周期细胞周期：一个细胞的分裂生长周期时间。倍增时间：指在对数生长期细胞数量增加一倍所用的时间，这一时间内一般有些细胞参与分裂有些细胞可能不参与分裂，有些可能分裂两次或数次，但细胞总数量增加1倍。第四节细胞培养中常用的染色方法•一、活体染色体外活体染色就是在体外条件下用某种染色剂（即活体染料）对活的组织或细胞进行染色，而不影响活细胞的生命活动的一种方法。利用这种方法，可以对培养物进行染色观察，染色后的培养物还可以继续进行培养。•1、活体染料的类别碱性染料酸性染料中性红，甲基兰刚果红，台盼蓝2、染料排除检测法第四节细胞培养的污染与检测•污染是组织培养的大敌，避免污染的发生。•污染一般包括微生物污染（细菌、真菌、支原体和病毒）、化学物（影响细胞生存的非细胞所需的化学成分）、细胞（非同种的其他细胞）。一、污染途径•A.空气措施：减少空气流动•B.器材措施：消毒彻底，洗刷干净，定期消毒•C.操作措施：严格进行无菌操作，避免交叉感染•D.血清•E.组织样本很难避免二、污染对培养细胞的影响及检测•影响：细胞生长缓慢、分裂相减少、细胞变得粗糙、细胞轮廓增强、重者细胞停止增殖、分裂相消失、细胞质中出现大量堆积物、细胞变圆或崩溃从瓶壁脱落。•A.细菌的污染及检测取悬液培养，培养液颜色变黄，混浊。•B.真菌的污染及检测可见菌丝，显微镜下可观察到链状排列的菌珠，散在细胞周围和细胞之间生长。•C.支原体污染常见而棘手，与细胞共存。借助显微镜、电镜、DNA荧光处理法等观察。•D.病毒的污染及检测•E.细胞交叉污染及检测操作不当、共同培养导致不同种类之间发生混乱，细胞生长特征、形态发生变化。有效防止细胞的交叉污染：1）在进行多种细胞培养时器具要严格区分；2）器具不要触及培养瓶口以免把细胞带到培养瓶中；3）保存细胞，污染后可以复苏。三.污染的预防•防止污染，预防是关键。•1）、培养操作前的准备超净台保持清洁；使用消毒后的器皿。•2）、培养操作时的注意事项见无菌操作的注意事项。四、污染的排除•1、使用抗生素；•2、加温处理；•3、动物体内接种除菌法；•4、巨噬细胞吞噬法思考题•1、细胞培养时如何预防污染？•2、列举无菌操作的注意事项。