目的基因的克隆与分离鉴定(2)

生物技术专业核心课程基因工程6目的基因的克隆与分离鉴定目的基因的克隆目的基因的分离鉴定基因克隆与基因分离1、克隆个体水平上的克隆细胞水平上的克隆分子水平上的克隆2、基因克隆分子水平上的克隆，将某一段DNA或一个基因插入到一个载体分子上，并导入特定的宿主细胞中，形成寄主/载体单元，称为一个克隆。3、基因分离从复杂的基因组中分离出单个具特定功能或特性的基因或DNA片段。该基因的功能或序列并不一定要了解。基因工程或DNA重组技术的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因。确定其表达调控机制和生物学功能；建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞）；将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰；然后转入受体细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；第一节目的基因的克隆CPCR法BcDNA法A鸟枪法D化学合成法E基因文库的构建一、鸟枪法鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法操作的改进鸟枪法克隆目的基因的局限性(一)鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法（shot-gunapproach)：随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离。1.染色体DNA的切断超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端；全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控；部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整。2.与载体连接如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体；3.转化受体细胞如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞；4.筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为的受体细胞。问题鸟枪法获得的克隆群体庞大以人的基因组为例，如果载体承受外源DNA片段的能力为1-3kb；那么,人类基因组DNA需被切割成几十万个大小不等的片段；每个片段都分别插入到一个载体分子上，这样就会形成由几十万个不同的重组分子组成的克隆群体；要想从如此巨大的克隆群体中筛选带有目的基因的克隆，显然是非常费事的。(二)鸟枪法操作的改进如果已知目的基因两端的酶切位点，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率。使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离；在连接前将DNA片段进行分级分离2.0kb1.6kb1.8kb用刀片切下相当于1.6-2.0kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进行拼接。凝胶DNA片段回收技术冻融法滤纸法吸附法低融点凝胶法溶解法凝胶DNA片段回收程序1.切胶回收于离心管中；2.加入等体积的溶液I；3.50-60℃水浴加热约10分钟至胶融解；4.加入到DNA纯化柱内，室温放置1分钟；5.离心1分钟，倒弃收集管内的液体；6.加入700微升溶液II，室温放置1分钟；7.离心1分钟，洗去杂质；8.加入500微升溶液II，最高速离心1分钟；9.将DNA纯化柱置于1.5ml离心管上，加入30ul溶液III至管内柱面上，放置1分钟；10.高速离心1分钟，所得液体即为高纯度DNA。(三)鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构二、cDNA法cDNA法克隆目的基因的基本战略cDNA法分离目的基因的基本程序cDNA法克隆目的基因的局限性(一)cDNA法克隆目的基因的基本战略mRNA1.cDNA第一链的合成5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’cDNA第一链引物退火逆转录酶dNTPs2.cDNA第二链的合成煮沸NaOH自身引导法：获得的双链cDNA5’端会有几对碱基缺失5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’TTTTTTTTTTTTTTp5’AAAAAAAAAAAAAAOH3’AAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTOH3’KlenowdNTPsS1TTTTTTTTTTTTTTp5’DNApoldNTPsRNaesH置换合成法：获得的双链cDNA5’端也会有几对碱基缺失5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’S15’AAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’3’T4-DNAligase5’AAAAAAAAAAAAAAp3’TTTTTTTTTTTTTTOH5’5’AAAAAAAAAAAAAA3’TTTTTTTTTTTTTT5’dCTPTdT引导合成法：获得的双链cDNA能保留完整的5’端序列5‘ppp’5GGAAAAAOH3’TTTTTp5’3‘HO5‘ppp’5GGAAAAACCCCCCCOH3’3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’5‘pGGGGGGG3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’5‘pGGGGGGGAAAAAOH3’NaOH退火KlenowdNTPs3.双链cDNA的克隆双链平头的cDNA与载体的连接：平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收(二)cDNA法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA结构细菌或原核生物的mRNA半衰期很短mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难仅限于克隆蛋白质编码基因三PCR法使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。(一)PCR法定向扩增目的基因的基本原理PCR（PolymeraseChainReaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序。5‘5‘目的基因变性加热5‘5‘引物退火5‘5‘底物聚合5‘加热变性5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘退火引物底物聚合加热变性引物退火底物聚合1235‘由TaqDNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为TaqDNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的T载体克隆。(二)PCR克隆目的基因的基本程序5’5’AATT5’5’PCR扩增产物T载体T7lacZMCSoriApr四化学合成法化学合成法的基本战略化学合成的单元操作DNA化学合成的用途一、化学合成DNA的发展二、化学合成寡核苷酸片段的主要方法磷酸二酯法磷酸三酯法亚磷酸三酯法固相合成法自动化法(ChemicalSynthesisoftheGene)三、化学合成DNA（寡核苷酸）的应用作为合成基因的元件作为测序的引物作为核酸分析杂交的探针用于基因定点诱变研究作为PCR反应的引物作为重组DNA连接等的构件(一)化学合成法的基本战略全基因合成化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略：1.小片段粘接法：混合退火根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段T4-DNA连接酶连接连接入合适的载体2.补钉延长法：混合退火根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体Klenow酶聚合3.大片段酶促法：混合退火根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体Klenow酶聚合(二)化学合成的单元操作化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、缩合、氧化、去保护等步骤；从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式；前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的。化学合成的单元操作OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeOHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeHDMT：二甲氧基三苯甲基激活缩合氧化脱取代基玻璃珠连接臂OHGHHHHOCH2ODMTPOMeOHAHHHHOCH2OO(三)DNA化学合成的用途合成天然基因修饰改造基因设计新型基因制备探针、引物、接头如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等。如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等。全基因合成的问题上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%，则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%第一节目的基因的克隆三、PCR法二、cDNA法一、鸟枪法四、化学合成法五、基因文库的构建五、基因（组）文库的构建基因文库的基本概念基因文库的构建程序(一)基因文库的基本概念基因库与基因文库基因库（genepool）特定生物体全基因组的集合（天然存在）基因文库（genelibraryorgenebank）将特定生物个体的全部DNA片段连接入载体DNA分子上，并导入受体细菌或细胞中，经扩增产生的包含该生物全部基因组序列的克隆群体。（人工构建）基因组文库（含有全部基因）cDNA文库（含有特定时期或组织中蛋白质编码基因）根据构建方法的不同，基因文库分为：基因文库构建的基本战略用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA。用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA。在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等。很显然，cDNA文库的信息量远小于基因组文库。1.重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力；2.载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆；3.克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序；4.克隆片段易于从载体分子上完整卸下；5.重组克隆能稳定保存、扩增、筛选；6.具有较高的完备性。基因文库的质量标准基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：N=ln(1–P)/ln(1–f)其中：P=任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小基因文库的完备性例如，人的单倍体DNA总