热原试验 演示文稿

热原检查法家兔热原试验试验目的将一定剂量的供试液(医疗产品的萃取液)，静脉注入家兔体内，在规定的时间内观察家兔体温升高的情况，以判定供试品是否具有潜在的致热作用。依据方法：GB/T14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法；中国药典2010；ISO10993-12:2005{GB/T16886.12-2005}.热原试验的应用热原试验应用于药物及医疗产品的检测（注射器、输液器、输血器、引流管、手术器械等等）热原概念热原：引入或释放到机体内后能引起恒温动物体温异常升高的物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。细菌性热原，是某些细菌的代谢产物、细菌尸体及内毒素。致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌的产物，其次是革兰阳性杆菌类，革兰阳性球菌则较弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能产生热原。热原引起机体发热机理外源性致热原多为大分子物质，特别是细菌内毒素分子量非常大，不能通过血脑屏障直接作用于体温调节中枢，而是通过激活血液中的中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核一吞噬细胞系统，使其产生并释放内源性致热原，通过下述机制引起发热。热原引起机体发热机理热原—白细胞(WBC)—吞噬—白细胞崩解，释放内源性致热源原—作用于体温调节中枢—产热增加、散热减少—体温上升实验设备及材料超净工作台、电热干燥箱、水浴锅、天平、电子称、肛门体温计（仪器设备需经国家相关部门检定）、注射器、三角烧瓶、棉球、家兔固定架、时钟等等。所用试剂：医用生理盐水、75%乙醇、凡士林。供试液的制备依据标准：ISO10993：12（GB/T16886.12）按0.2g:1ml（样品:生理盐水）的比例进行萃取，条件为37±1℃，时间为72±1小时。萃取液应在2小时内使用完毕。试验家兔饲养环境1在做热原检查前1~2日，供试用家兔应处于同一温度环境中；2实验室和饲养室的温度相差不得大于3℃，实验室的温度应控制在17~25℃；3在试验全部过程中，应注意室温的温度变化不得大于3℃，防止动物骚动并避免噪声干扰。试验家兔的选择1.未曾用于热原检查的家兔；2.或供试品判定为符合规定，但组内升温达0.6℃的家兔；3.或3周内未使用的家兔，均应在检查供试品前3~7日内预测体温，进行挑选。挑选试验用家兔的条件与检查供试品时相同，仅不注射药液，每隔30分钟测量体温1次，共测8次，8次体温均在38.0~39.6℃的范围内，且最高与最低相差不超过0.4℃的家兔，方可供热原检查用。试验家兔的选择㈠家兔应健康，雌雄不限，体重1.7kg以上，雌兔应无孕。预测体温前7日即应用同一饲料饲养，在此期间内，体重应不减轻，精神、食欲、排泄等不得有异常现象(科学饲养)。㈡用于热原试验后的家兔，如供试品判定为符合规定，至少应休息48小时方可再本试验用，其中体温升高0.6℃以上的家兔，至少休息两周后以上。如供试品判定为不符合规定，则组内全部家兔不再使用。每一家兔的使用次数，用于一般药品的检查，不应超过10次。试验家兔的选择（一）家兔在试验前至少1小时开始停止给食并置于适宜的装置中，直到试验完毕。应使用精密度为±0.1℃的测温装置测量家兔体温。测温探头或肛温计插入肛门的深度和时间各兔应相同，深度一般约6cm，时间不少于1.5分钟，每隔30分钟测量体温1次，一般测量2次，两次体温之差不得超过0.2℃.试验前家兔的准备试验前家兔的准备（二）以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温。当日使用的家兔，正常体温应在38.0~39.6℃的范围内，且各兔间的正常体温之差不得超过1℃.试验前器械的准备注射器（带针头）及一切与供试品溶液接触的器皿应是无菌、无热原，如试管等应采用干热灭菌法置烘箱中用250℃加热至少30分钟，也可用其他适宜的方法除去热原。试验方法取适用的家兔3只，测定其正常体温后15分钟以内，自耳静脉缓缓注入规定剂量(10ml/kg)并温热至约38℃的供试品溶液，然后每隔30分钟按前法测量其体温1次，共测6次，以6次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔体温的升高温度。试验方法如3只家兔中有1只体温升高了0.6℃或0.6℃以上，或3只家兔体温升高均低于0.6℃，但体温升高的总和达1.3℃或1.3℃以上，应另取5只家兔复试，检查方法同上。结果判断㈠在初试的3只家兔中，体温升高均低于0.6℃，并且3只家兔体温升高总和低于1.3℃；或在复试的5只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔不超过1只，并且初试、复试合并8只家兔的体温升高总和为3.5℃或3.5℃以下，均判为供试品的热原检查符合规定。结果判断㈡在初试的3只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔超过1只；或在复试的5只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔超过1只；或在初试、复试合并8只家兔的体温升高总和超过3.5℃，均判为供试品的热原检查不符合规定当家兔体温升高为负值时，均以0℃计。展望检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001μg/ml,试验结果接近人体真实情况，但操作繁琐费时，不能用于注射剂生产过程中的质量监控，且不适用于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒性药物制剂。注意事项（1）试验室内保持安静，避免强烈直射阳光、灯光等刺激。（2）试验过程中避免家兔骚动，保持体温稳定。（3）试验室、饲养室温度及其变化应符合要求。（4）试验过程中不得随意更换肛门体温计。记录表格编号体重（kg）试验前体温(℃)试验后体温(℃)体温上升(℃)12X12345612.022.331.8