第四章 目的基因

第四章目的基因基因的获取、克隆与鉴定无论是确定某基因的表达调控机制和生物学功能还是建立高效表达系统，构建有价值的基因工程菌（细胞），亦或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后再输入回细胞改良生物体的遗传性状，前提是：从生物体基因组中分离克隆目的基因。单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。为了解决这个难题，一种可行的方法就是将DNA进行扩增，增加成功分离目的基因的可能性。然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来，最后分离得到目的基因。获得目的基因的方法：建立基因文库、聚合酶链式反应（PCR）、化学合成法。§4.1基因组文库的构建基因文库（genelibrary）又称DNA文库，是指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成。按照外源DNA片段的来源，可将基因文库分为基因组DNA文库（genomicDNAlibrary）和cDNA文库（complementaryDNAlibrary）基因组DNA文库包含某种生物基因组全部遗传信息的一系列DNA片段，通过克隆载体贮存在一种受体菌的群体之中，这个群体称为这种生物的基因组文库。cDNA文库：某生物基因组经转录和反转录产生的各种cDNA片段分别与合适的克隆载体连接，通过转化贮存在一种受体菌的群体之中。把这种包含某生物基因组全部基因cDNA的受体菌群体称为该生物cDNA文库。一、构建基因组文库流程（1）分离纯化基因组DNA。（2）制备全部基因组的DNA片断；①机械断裂法（用超声波或高速搅拌DNA溶液）②限制性内切酶降解（鸟枪法）（3）DNA片断与载体的连接包装；（4）侵染宿主细胞；（5）重组克隆的挑选和保存。二、鸟枪法克隆基因的基本战略1.鸟枪法克隆基因的策略（1）染色体DNA的切断：超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整（2）与载体连接：如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体；（3）受体细胞：如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为转化受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞；（4）筛选含有目的基因的目的重组子：菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）2.鸟枪法操作的改进使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6-2.0kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进行连接。在连接前将DNA片段进行分级分离3.鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识；不能获得的最小长度的目的基因；不能除去真核生物目的基因的内含子结构。三、利用质粒载体构建基因组文库基因组DNA+粘性质粒重组DNA转化细菌菌落该法简单、快速、易于操作，但仅适合一些低等真核生物和原核生物。四.利用λ载体构建基因组文库基因组DNA+λ噬菌体重组DNA包装成噬菌体感染细菌噬菌斑限制性内切酶基因重组转化细菌体外包装基因组DNA五、人工染色体构建文库包括酵母人工染色体文库、细菌人工染色体文库和P1人工染色体文库，也称大片段基因组DNA文库，容纳外源DNA片段为100kb-1Mb六、基因组DNA文库的质量标准一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：基因组文库必须具有一定的代表性和随机性，更要便于筛选。①重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力；②载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆；③克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序；④克隆片段易于从载体分子上完整卸下；⑤重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。文库的质量检测：文库平均插入片段：PFGE电泳检测一定数目克隆子插入片段的平均值插入效率：有插入片段的克隆在所监测的克隆中所占的比例基因组覆盖度：文库中克隆覆盖基因组的范围基因组覆盖倍数：①平均插入片段长度×克隆数基因组DNA长度②探针筛选的阳性克隆总数/使用的总探针数文库中含克隆数目七、基因组文库大小的计算1975年L.Clarke等提出了一种计算完整的基因组文库最低重组体所需实际克隆数（N）的公式：In（1－P）N=———————In（1－f）P为在基因组文库目的基因出现的几率（一般为99％）；f为插入的限制片断长度／整个基因组DNA总长度。例如：从人基因组DNA（总长度为3×109bp）的文库中筛选到长约1.5kb目的基因的可能性为99％，那么这个基因组文库要多大？In（1－0.99）N=——————————————=9.2×106In（1－1.5×103／3×109）若用质粒（pBR322）克隆目的基因（1.5kb）需要有9×106克隆才能汇集人基因组全部DNA序列;若用λ噬菌体载体可构建含15kb目的基因的人基因组DNA文库，按上式计算所需要的重组体克隆数可以减少到9×105,而要用柯斯质粒将40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降到3.5×105左右,均可满足建库要求。三种常用基因组文库克隆载体的比较载体种类装载量转染率λ噬菌体粘性质粒(Cosmid)酵母人工染色体9～22kb30～45kb100～1000kb105～106转化子／μgDNA104～106转化子／μgDNA～500转化子／μgDNA§4.2cDNA文库的构建真核生物基因组DNA十分庞大，难以从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因。高等生物一般具有105种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，只有15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。cDNA文库（complementaryDNAlibrary）：以mRNA为模板在反转录酶的作用下将形成的互补DNA（cDNA）建立基因文库（genelibrary）。特点：①cDNA无内含子,长度较基因组基因小,使操作更为方便。②mRNA比基因组中基因少,因此筛选某一特定功能基因工作量较小。③mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数,利于获得较多的模板。（转录特征）④可在原核细胞中表达有生物活性蛋白。⑤不同种类不同状态的细胞的cDNA文库不同。⑥不能研究基因组的结构功能。一、构建cDNA文库流程1.细胞总RNA的提取和mRNA的分离2.双链cDNA的合成a.单链cDNA的合成：反转录法；b.第二条cDNA的合成：碱解或酶解（RNaseH）法除去RNA分子3.双链cDNA与载体DNA相连a.人工接头；b.同聚物加尾；c.cDNA的定向插入。4.重组cDNA分子的转移和文库的建立：选用载体为质粒，可直接转化E.coli；若为λ载体，则需进行体外包装、感染等。二、细胞总RNA的提取和mRNA的分离一段仅由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸【oligo（dT）】能够同惰性物质如纤维素或琼脂糖结合，这样当细胞总RNA通过寡聚纤维素柱时，mRNA分子的poly（A）尾巴便会同oligo（dT）序列杂交而粘附到柱子的填充物上。三、第一链cDNA的合成1.oligo(dT)引导的DNA合成法：利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一链。缺陷：因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5’－末端，必须从3’－末端开始合成cDNA。对于大分子量的较长的mRNA分子而言，特别麻烦。2.随机引物引导的cDNA合成法(randomlyprimedcDNAsynthesis)：根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。在应用这种混合引物的情况下，cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生，而不仅仅从3’-末端的oligo(dT)引物一处开始。四、第二链cDNA的合成cDNA第二链的合成就是将上一步形成的mRNA-cDNA杂合双链变成互补双链cDNA的过程。cDNA第二链的合成的方法大致4种：自身引导合成法、置换合成法、引导合成法、引物－衔接合成法。1.自身引导合成法获得的单链cDNA3’端会形成发夹结构的能力，以此作为第二链合成的引物，在大肠杆菌聚合酶IKlenow片段或反转录酶的作用下，合成cDNA的第二链。缺点：在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时，会导致对应于mRNA5’端的地方的序列出现缺失和重排。S1核酸酶的纯度不够时，会偶尔破坏合成的双链cDNA分子。2.置换合成法原理：以第一链合成产物cDNA：mRNA杂交体作为切口平移的模板，RNaseH在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口，产生一系列RNA引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链。优点：a.合成cDNA的效率高b.直接利用第一链的反应产物，不需纯化c.避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA3.引导合成法获得的双链cDNA能保留完整的5’端序列4.引物-衔接头法五、双链cDNA与载体DNA相连由于大片段的平末端连接效率非常低，除了直接连接平末端与载体，对双链cDNA的末端进行加工是十分必要的。双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：1平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收2平头两端分别接同聚物尾，最好是核苷酸同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段3加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收六、基因组DNA文库与cDNA文库的比较①从cDNA克隆中，不能克隆到基因组DNA中的非转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能。②cDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。③cDNA文库虽能反映mRNA的分子结构和功能信息，但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构与功能方面信息。④在cDNA文库中，相应于高丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例则比较低，因此分离也就比较困难。⑤cDNA文库以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。⑥cDNA文库的筛选比较简单易行。⑦每一个cDNA文库都含有一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因。⑧cDNA文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，直接应用于基因工程操作。⑨cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能研究。§4.3基因文库的筛选与鉴定重组体(recombinant，转化子transformant)：就是掺入或导入外源DNA后获得了新遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。1表型筛选法(1)抗药性筛选（插入失活筛选法）:这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法。经过上述抗药性筛选获得的大量转化子中既包括需要的重组子，也含有不需要的非重组子。为了进一步筛选出重组子，可利用质粒载体的双抗药性进行再次筛选。一、基因文库的筛选抗药性标记选择(插入失活法)(2)显色反应选择法(α-互补法