第05章 代谢物酶法分析技术

第五章代谢物酶法分析技术江苏大学郑铁生全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术2教学目标与要求掌握：代谢物酶法分析技术的概念，单酶反应直接法、酶促偶联法等方法的设计原理，脱氢酶和过氧化物酶指示系统的应用原理，以及平衡法和速率法的设计要求。熟悉：代谢物酶法分析技术的理论基础，酶循环法、酶活性恢复法、激活剂和抑制剂测定法的设计原理，平衡法和速率法的优缺点。了解：试剂酶的质量要求，以及代谢物酶法分析技术的发展前景。全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术3代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测定人体內的代谢物或代谢产物的技术。酶法分析（enzymaticmethod）是以酶为试剂测定酶促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及利用酶促反应测定酶活性的一类方法。代谢物酶法分析技术的概念全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术4目录代谢物酶法分析的理论基础1代谢物酶法分析的方法2代谢物酶法分析的设计要求3小结与展望4返回总目录全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术5代谢物酶法分析平衡法（终点法）速率法（动力学法）代谢物酶法分析的理论基础1全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术6平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促反应逐渐被消耗，当剩余的底物量很小（1%～5%）时，指示反应信号逐渐达到平衡，即通常所说的终点，所以又称为终点法(end-pointmethod)。平衡法的特点是测定底物的总变化量，即测定的是“浓度”。平衡法基本理论(1)全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术7SKmSVvmaxSKmSVdtSdvmaxdtSVSKmSdmax)(dtVSVKmSd)max1max(maxlgmax303.200VSSSSVKmttt积分得：米氏方程改写为式中[S0]为待测物，[St]为待测物至反应t时间后的浓度。平衡法基本理论(1)全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术8若反应达到平衡，假设，即[S0]－[St]≈[S0]，%10SStmaxlgmax303.200VSSSSVKmttt以上积分式：则可简化为：maxmax606.40VSVKmt说明达到平衡所需的时间与Km、Vmax、[S0]有关，Km越小、Vmax越大（加入酶量越多）、[S0]越小（待测物越少）则达到平衡所需的时间越短。平衡法基本理论(1)全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术9若[S0]KmdtSVKmSdmaxdtSVSKmSdmax)(tSSVKmt0lgmax303.2积分得：可简化为：若同时做标准管，不管反应到达何种程度，只要标准管与测定管反应时间（t）一致，则有：ttSSlgSSlg测定管测定管标准管标准管00ttSSSS测定管测定管标准管标准管00平衡法基本理论(1)全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术10ttttSSSSSSSS0000测定管标准管测定管标准管测定管标准管标准管的[S0－St]与待测管的[S0－St]分别代表消耗量，也代表转化为产物的量，可以用产物的吸光度来表示（As和Au）。标准管的[S0]与测定管的[S0]分别表示为Cs和Cu。AuAsCuCs可简化为：平衡法基本理论(1)全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术11AuAsCuCs当[S0]－[St]≈[S0]，即反应基本达到平衡，Au和As基本稳定不变，此时测定误差最小。如果存在基质效应，两者反应程度不一，若按上式计算就会带来误差。此式是平衡法测定代谢物的基本原理ttttSSSSSSSS0000测定管标准管测定管标准管测定管标准管此公式成立是前提条件平衡法基本理论(1)全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术12速率法(rateassay)又称动力学法、连续监测法，测定的是速率（通常指的是初速度），依据是当底物的消耗量较小时(5%)，酶促反应呈一级反应，此时的反应速度（v）与代测物的浓度成正比例。速率法的关键是如何使酶促反应成一级反应。速率法基本理论(2)全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术13SKmSVvmax根据米氏方程：①当[S]Km，则[S]+Km≈Km②当酶量固定不变时，酶促反应的最大速度Vmax也不变符合一级酶促反应SKKmSVvmax米氏方程改为：速率法基本理论(2)全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术14若同时带标准管，则有：][][SSvv测定管标准管测定管标准管标准管的[S0]与测定管的[S0]分别表示为Cs和Cu，速度用△A/min来表示。上式改写为：CuCsmin/min/测定管标准管速率法测定代谢物浓度的原理前提条件是测定初速度。越偏离初速度，测定误差则越大。速率法基本理论(2)全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术15在临床操作中，只要测定期间待测物消耗5%，只要测定两个固定时间的吸光度差值，就可以采用标准浓度对照法计算样本浓度，这种方法又称为固定时间法(fixedassay)。速率法基本理论(2)全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术16平衡法的开始一段时间都有可能遵循一级反应规律。相反，速率法只要时间足够长，也会达到平衡。对于平衡法来说关键是确定达到平衡所需的时间。对于速率法来说关键是如何使酶促反应成一级反应。平衡法与速率法的相互联系返回章目录全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术17酶作用的特异性高，血清等体液样品不需预处理就能测定，简化了实验程序；试剂酶大多是蛋白质，没有毒性，避免了化学品对环境的污染；酶促反应温和，制成试剂盒可适用于自动分析。代谢物酶法分析主要优点代谢物酶法分析在准确性、精密度、灵敏度和线性测定范围等方面都优于传统的化学法代谢物酶法分析的方法2全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术18待测物与产物在理化性质上有便于检测的信号，如吸收光谱不同则可直接测定待测物或产物本身信号的改变来进行定量分析的方法称为直接法。单酶反应直接法(1)全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术19单底物反应直接测定法尿酸+O2+H2OUAO尿囊素+CO2+H2O2胆绿素+H2OBOD胆红素+O2尿酸在293nm处有吸收，而尿囊素没有吸收，在293nm处测定吸光度下降胆红素在450nm处有吸收，而胆绿素没有吸收，在450nm处测定吸光度下降尿酸紫外法测定胆红素测定全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术20双底物反应直接测定法对于双底物反应，为了便于实验分析，在实验设计时一般将所加的另一种底物浓度设计得相当大，即[S2]Km2，这时的酶促反应动力学可按单底物法处理，整个反应只与待测物有关，呈一级反应动力学。但在以NADH或NADPH为底物的终点法测定中，因340nm吸光度的限制，辅酶的用量不可能过高。全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术21在340nm处测定吸光度的增加来进行定量的方法乳酸测定双底物反应直接测定法LD乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+丙酮酸测定在340nm处测定吸光度的下降来进行定量的方法乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+LD全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术22酶促反应的底物或产物如果没有可直接检测的成分，将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而达到检测目的的方法称酶促偶联法。最常用的偶联指示系统有两个：一个是脱氢酶指示系统，另一个为过氧化物酶指示系统。ACBAEiEa酶偶联法(2)全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术23脱氢酶指示系统氧化型辅酶NAD(P)+在340nm处没有吸收峰,还原型辅酶NAD(P)H在340nm处有吸收峰.全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术24脱氢酶指示系统以脱氢酶为指示酶的系统测定的是氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)或氧化型辅酶Ⅱ(NADP+)变为还原型NAD(P)H后在340nm处的吸光度增高来计算出被测物的浓度，也可利用脱氢酶的逆反应，将还原型NAD(P)H变为氧化型NAD(P)+，测定340nm处吸光度的下降来计算被测物的浓度。全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术25脱氢酶指示系统血清葡萄糖己糖激酶法测定Glu+ATPG-6-P+ADPPDG6G-6-P+NADP+P-6-GA+NADPH+H+指示酶反应将NADP+转化为NADPH+H+，测定340nm吸光度上升的速度与葡萄糖的含量成正比全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术26脱氢酶指示系统血清尿素测定尿素+H2O尿素酶2NH3+CO2NH3+α-酮戊二酸+NADH+H+谷氨酸+H2O+NAD+测定340nm吸光度下降的速度与尿素的含量成正比，可以用速率法测定；也可以用平衡法测定全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术27常用的试剂酶有乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。体液葡萄糖、尿素、肌酐、甘油三酯、胆汁酸、乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、唾液酸以及氨、钾、镁等离子的酶法测定大多使用该指示系统。脱氢酶指示系统全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术28过氧化物酶指示系统共用的指示反应最早由Trinder氏等人提出，被称为Trinder反应最大吸收峰为500nm，在可见光范围内比色。已广泛用于葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油三酯等项目的测定全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术29过氧化物酶指示系统血清总胆固醇氧化酶测定法COD胆固醇酯+H2O胆固醇+O2胆固醇+脂肪酸△4-胆甾烯酮+H2O2红色醌类化合物H2O2+4-AAP+酚指示酶反应生成的红色醌类化合物可在500nm处比色测定全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）第五章代谢物酶法分析技术30化学名英文缩写最大吸收峰（nm）酚2，4-二氯酚N-乙基-N-（3-甲苯）-N-乙酰乙二胺N-乙基-N-（2-羟基-3-丙磺酰）间甲苯胺N-乙基-N-（3-丙磺酰）-3，5二甲氧基苯胺P2，4-DCPEMAETOOSESPDMA500510555555585过氧化物酶指示系统常用的Tr