cDNA文库的构建和筛选

第五章cDNA文库的构建和筛选将RNA转变成cDNA以及cDNA文库构建cDNA文库筛选策略cDNA表达文库的功能筛选用cDNA检测基因的表达体外克隆编码细胞内信号蛋白的基因细胞中总RNA•信使RNA(mRNA):1-5%.作为蛋白质合成的模板。•核糖体RNA(rRNA):80%.构成核糖体，参与蛋白质翻译•转运RNA(tRNA):10-15%.将mRNA中的信息翻译成氨基酸（携带正确的氨基酸）信使RNA的表达在生物体内具有组织和时空特异性。因此，mRNA对于了解细胞中的信息流非常重要.•Size–examinedifferentialsplicing（检测可变剪接）•Sequence–预测蛋白产物•Abundance–检测表达水平•Dynamicsofexpression–不同的时间、发育阶段和组织的特异性。mRNA特点第一节：将mRNA转变成cDNAcDNA：与mRNA互补的DNA，称为cDNA。由某个生物体的某个器官或组织mRNA反转录形成的总cDNA，构建形成的基因文库，称之为cDNA文库RNADNA2´OHgroup(ribose)2´H(deoxyribose)UracilbindsAdenine(A,U,C,G)ThyminebindsAdenine(A,T,C,G)MultipletypesandrolesOnebiologicalformOftenpermanentlymodifiedviasplicingPermanentlymodificationsarerare(mutation)Usuallysingle-strandedDoublestrandedIntermolecularbindingDoublehelixstructure一、mRNA的分离纯化一、mRNA的分离纯化RNA在体内具有容易被内切核酸酶（RNase）降解以及自然降解的特性。分离以及保存RNA需针对上述特点进行。加入RNase抑制剂第一节：将mRNA转变成cDNARNA分离•TotalRNAfrombiologicalsamples–Organicextraction–Affinitypurification•mRNAfromtotalRNA–Oligo(dT)resins•mRNAfrombiologicalsamples–Oligo(dT)resinsRNA分离从生物体内分离totalRNA（有机分离法）Lyse/homogenizecells加入酚:氯仿:异戊醇到裂解细胞中并离心Organicphaseseparatesfromaqueousphase•有机相在底层•水相在上层(containstotalRNA)•洗白破碎物以及大片段的基因组DNA在两相界面吸取上清至新管乙醇沉淀RNA并用水重新溶解用层析柱分离总RNALysecells,andspintoremovelargeparticulates/celldebrisApplylysate(containingnucleicacidsandcellularcontaminants)tocolumnwithglassmembrane用乙醇洗涤柱子，核酸结合在柱子上，其他物质从侄子中流出。用DNase处理污染的DNAApplywatertothecolumn;purifiedRNAwashesofftheglassandiscollected•mRNA的3’末端具有polyA尾巴•Oligo(dT)探针用于分离总RNA中的mRNA•mRNAcanbeelutedfromoligo(dT)matrixusingwaterorlow-saltbufferMessengerRNAIsolationMessengerRNAIsolation二、cDNA的合成A、用polyT作为引物GUAAUCCUCAAAAAAAAAAAAAAAReversetranscriptasemRNAcDNATTTTTTTTTTTTTTT逆转录polyT引物第一节：将mRNA转变成cDNAB、基因特异的引物C、随机引物第一节：将mRNA转变成cDNA在构建cDNA文库之前，需要将单链cDNA合成双链，主要有以下二种种方法：A、降解mRNA-cDNA杂合链中的RNA，cDNA第一链3’端回折充当引物，形成第二链mRNAcDNAAAAAAAAAATTTTTTTTTB、用来自E.coli中的RNaseH降解的RNA充当引物，在DNA聚合酶和连接酶的作用下合成第二链DNA第一节：将mRNA转变成cDNAmRNAcDNATTTTTTTTTcDNA文库的组建：基因重组反转录酶mRNAcDNAcDNA文库的特点cDNA文库代表了某个器官或组织中的RNA群体。在某个给定的cDNA文库中某些表达丰富的mRNAs的克隆数目比较多，在文库中也有少数的克隆代表稀少mRNAs如果某个基因有多种拼接方式，在文库中也有代表该基因不同拼接方式的克隆。第一节：将mRNA转变成cDNA三、cDNA克隆载体1、根据不同的筛选策略选择不同的载体质粒载体：用功能测定的方法进行筛选噬菌体载体：分子杂交或抗体筛选。2、噬菌粒载体：是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。三、cDNA克隆载体它是包含了丝状噬菌体大间隔区域的质粒，是一种双链质粒，含噬菌体来源的复制子，在细菌的细胞中出现有辅助噬菌体的情况下，可被诱导成单链DNA噬菌粒同时具有噬菌体和质粒的特征，可以像噬菌体或质粒一样复制。。优点：1.双链DNA既稳定又高产，具有常规质粒的特征；2.免除了将外缘DNA片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一繁琐又费时的步骤；3.由于载体足够小，故可得到长达10kb的外源DNA区段的单链。第二节cDNA文库的筛选基因序列未知常用筛选cDNA文库的方法A、用已知氨基酸序列来获得简并序列B、纯化蛋白质相应的抗体C、利用同源基因（?）中的目标基因序列D、利用差异表达基因的扣除cDNA探针某些基因编码的蛋白质的性质已知通过氨基酸序列反推核苷酸序列TGG-GAT/C-GAA/G-AAT/C-AAT/C-ATG进行至少两轮的筛选才能获得阳性的克隆A、用已知氨基酸序列来获得简并序列B、利用抗体进行杂交免疫学筛查：检测克隆基因编码的蛋白免疫学筛查所需要的抗体免疫学筛查首先获得抗原抗原一抗二抗信号放大特点是：已知蛋白产物，但对其核酸序列或氨基酸序列基本未知利用的基因文库必须是表达文库，能够表达抗原C、利用同源基因中的目标基因序列用不同来源的DNA分子制备成探针进行检测。如：用来自鼠的基因A去检测人类中基因A或基因家族中成员A去检测成员BD、利用差异表达基因的扣除cDNA探针差示杂交P112提取mRNART反应制备标记的cDNART反应获得cDNA获得cDNA文库转膜转膜杂交获得杂交信号杂交获得杂交信号目标基因阳性克隆表达目标基因提取mRNART反应制备标记的cDNA不表达目标基因D、利用差异表达基因的扣除cDNA探针扣除杂交P112剪切用生物素标记变性、退火和杂交过柱B基因流出进一步构建文库获得目标基因ABCAC第三节cDNA表达文库的筛选研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用酵母双杂交技术噬菌体展示技术1、噬菌体展示技术原理A、噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达。B、融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。C、被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。第三节cDNA表达文库的筛选第三节cDNA表达文库的筛选D、肽库与被测试的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体E、洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱F、经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。第三节cDNA表达文库的筛选2酵母双杂交系统原理A、转录激活因子GAL4N端：147个氨基酸组成的DNA结合域(DNAbindingdomain,BD)C端：113个氨基酸组成的转录激活域(transcriptionactivationdomain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。B、酵母双杂系统的组成部分（1）与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白（bait）；（2）与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白（prey）；（3）带有一个或多个报告基因的宿主菌株。C、酵母双杂系统的工作原理第三节cDNA表达文库的筛选Gal4结合域LacZBDBait(X)LacZGal4激活域ADPrey(Y)LacZGal4激活域Gal4结合域BDADBait(X)Prey(Y)BaitgeneBDgeneBaitplasmidADgenepreygenepreyplasmidBDgeneBaitplasmidBaitgeneADgenepreygenepreyplasmid诱饵与靶蛋白之间的相互作用激活了报告基因的表达operatorRepotergeneoperatorRepotergeneoperatorRepotergeneBDX共转化+ADcDNANH2COOHGal4Leu-cDNAlibraryCOOHGal4Trp-NH2PromoterReporterBDXGal4?ADGal4第三节cDNA表达文库的筛选用途：快速筛选与一种已知蛋白结合的目的蛋白，发现新基因验证已知蛋白间的相互作用及作用强度酵母双杂交系统的小结优点：根据兴趣蛋白的基因序列即可筛选与其作用的目的蛋白蛋白质在真核细胞内，处于天然状态，蛋白质之间的相互作用符合细胞内情况，即使是两种蛋白质的瞬时结合也可被检测出来可以直接获得目的蛋白的基因序列，从而可以初步判断目的蛋白的结构和功能。酵母双杂交系统(YeastTwo-hybridSystem)局限性：表达的外源蛋白均为融合蛋白，可能与天然状态不符，造成结果的不准确本身就具有转录激活活性的兴趣蛋白不适合于该系统不能定位于核内的兴趣蛋白不适合于该系统需要翻译后修饰的蛋白不适合该系统酵母双杂交系统(YeastTwo-hybridSystem)第五节：体外克隆编码细胞内信号蛋白的基因研究目的鉴定突变体细胞中编码蛋白酶的cDNA克隆研究基础以及原理1、突变体细胞2、野生型细胞cDNA文库，且可进行体外翻译三、研究策略1、制备规范化的野生型cDNA文库自动制备质粒体外翻译突变体细胞提取物荧光反应底物检测荧光信号12345786ABCDEFGHIJKL12345786ABCDEFGHIJKL