第二章 质粒DNA的微量提取(SDS法)

实验二质粒DNA的微量提取碱裂解法（SDS法）一.目的与要求通过质粒的一些基本特性、质粒DNA的提取技术，学习用碱变性法提取质粒DNA的方法。二.相关知识质粒(Plasmid)：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。绝大多数是一种环状的双链DNA分子。广泛存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1Kb-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。质粒DNA的存在区域和结构特征电镜中质粒DNA的形态•严谨型：质粒的复制受到寄主细胞严格控制，与寄主细胞的复制偶联同步。因此，在一个细胞中只有1个或几个拷贝；•松驰型：质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200个拷贝。用一定的药物处理，抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。质粒类型：载体(Vector)：用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制或表达的质粒(运载工具)。具备的条件:1.具备条件（1）易于鉴定；（2）在受体细胞中可以独立复制；（3）易于筛选；（4）易于导入受体细胞。2.结构特征(1)抗性基因（Ampicillingene,Kanamycinegene)(2)启始复制子（ori)；(3)多克隆位点(MSC)；(4)标记基因(LacZgene)。InsertEcoRIXhoI1.9kbDNA是具有一定结构的物质，特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。三.原理：SDS是一种阴离子表面活性剂，既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。四.细菌裂解的方法：(1)碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS;(2)煮沸裂解法:沸水煮沸40s;(3)SDS裂解法：10%SDS,用于质粒大量提取。五.DNA浓度的测定：(1)分光光度计法:碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，一般在中性pH值左右的环境中进行测定。这种方法常测定比较纯的样品。(2)荧光的强度法：(3)凝胶电泳比对法，与标准分子量相比较。六.材料和仪器1.材料:含有质粒P3.5K-EGFP的大肠杆菌DH5α。P3.5K-EGFP是一种酵母荧光表达载体，常用于检测酵母中外源基因表达强度和亚细胞定位。2.试剂：裂解液一，裂解液二，裂解液三，酚氯仿，异丙醇，70%乙醇，TE等。3.仪器设备：高速离心机，移液器，摇床等4.加入400l新配制的裂解液二，加盖颠倒6-7次使之混匀，放置3-5min（不得超过5min）;七.质粒微量提取的方法培养细菌收集菌体悬浮菌体裂解菌体1.将带有质粒的DH5a接种到3-5ml含有amp抗生素的液体培养基，37℃培养12-16h;2.取液体培养液1.4ml于Ep管中，10000rpm离心1min，去掉上清液，重复步骤2；最后瞬时离心后，用移液器去除上清。（所有去除残液均用此法）3.加入200l裂解液一，涡旋混匀放置5min;5.加入300L裂解液三(乙酸钾溶液)，加盖后颠倒6-7次混匀，放置3-5min;中和复性6.用台式高速离心机，12000rpm离心10min。离心除杂12.将分离出的质粒DNA置于-20℃保存备用。9.沉淀用0.5mL70％乙醇清洗一次，12000rpm离心5min，弃上清，重复9；11.加入20-30l含有20g/mlRNase的ddH2O或TE溶解，室温放置15-30min，使DNA充分溶解.去蛋白沉淀洗涤7.将700L上清移入另一干净离心管，加入等体积的酚、氯仿（700ul），混匀。12000rpm离心10min。10.瞬时离心，用移液器将管底残余液体移除，小管倒置于吸水纸上，室温自然干燥至透明;样品干燥样品溶解样品保存8.取600L上清到另一离心管中，加入等体积冰冻异丙醇，混匀，12000r/min离心5min，弃上清;离心收集(1)取2l提取的质粒DNA，加入98L蒸馏水对待测DNA样品做1:50(或更高倍数的稀释);(2)蒸馏水作为空白,在波长260nm、280nm处调节紫外分光光度计读数至零。(3)加入DNA稀释液，测定260nm及280nm的吸收值，并记录。(4)通过计算确定DNA浓度或纯度，浓度单位为g/ml,dsDNA=50×(OD260)×稀释倍数补充内容—1.用分光光度计法定量DNA260nm读数用于计算样品中核酸的浓度，OD260值为1相当于约50g/ml双链DNA，33g/ml单链。可根据在260nm以及在280nm的读数的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度。一般DNA的纯品，其比值为1.8，低于此值说明有蛋白质或其它杂质的污染。补充内容—2.凝胶电泳检测DNA的浓度实验步骤实验步骤见下一个试验—《琼脂糖凝胶电泳技术的原理和方法》结果1%的琼脂糖凝胶，90V,40分钟。•NEB标准分子量片段(1kbDNALadder)1kbDNALadder虽然不能对DNA质量进行精确定量分析，但可以通过与相近的条带进行比较估算出大概的数据。片段碱基对质量110,00242ng28,00142ng36,00150ng45,00142ng54,00133ng63,001125ng72,00048ng81,50036ng91,00042ng10a51742ng*10b50042ng*0.5kb的条带由500bp和517bp组成，这样即使在低分子量区域条带的强度也比较均一。按0.5μg上样量计。应按13条带计算，因为3kb的量是其它片段量的近三倍存在的问题及注意事项1.无DNA沉淀或沉淀少：（1）不含有质粒；（2）裂解液2失效；（3）异丙醇沉淀时没有混匀。2.加入裂解液后存在不裂解团块：涡旋过程不彻底。3.沉淀干燥后不透明：沉淀的DNA含有大量杂质。4.沉淀干燥后有颜色：取上清时取到了有机相。5.电泳时条带不清晰：（1）菌体中不含质粒；（2）裂解时间过长；（3）没有去掉RNA。6.电泳时条带拖尾：（1）电压过大；（2）操作过程中太剧烈，出现了断裂；（3）缓冲液过时。