第三章__质粒载体

第三章质粒载体第一节质粒载体概况第二节质粒DNA的复制与拷贝数的控制第三节质粒载体的构建第四节重要的质粒载体第五节质粒载体的稳定性问题第一节质粒载体的概况质粒的定义、命名、分类、分布质粒的基本生物学特性质粒的分离与纯化一、质粒的定义、命名、分类、分布定义：质粒是一类寄宿于细胞内，独立于染色体外的自我复制并稳定遗传的环状双链DNA分子。命名：小写字母p代表质粒，两个大写字母代表发明者，后接实验编号，分类：分布：1、根据质粒的性状特征分为：1）F质粒：又叫F因子或性质粒(sexplasmid)。2）R质粒：通称抗药性因子。编码有一种或数种抗菌素抗性基因。3）Co1质粒：产生大肠杆菌素因子。编码有控制大肠杆菌素合成的基因。质粒分类2、根据质粒的传递性3、根据质粒的拷贝数4、根据质粒和细菌的关系5、质粒分布、大小和数目二、质粒的基本特性寄生性质粒DNA构型质粒DNA编码的表型质粒DNA的复制类型质粒的不亲和性其他特性大肠杆菌质粒分子的结构示意图2、质粒DNA分子的三种构型SC构型:是指两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称为共价闭合环形DNA(cccDNA)，即超螺旋的SC构型。OC构型:两条多核苷酸链中只有一天保持完整的环形结构，另一条出现一至数个缺口时，称开环DNA(ocDNA)，即OC构型；L构型:质粒DNA经酶切，发生双链断裂而形成线性分子(LDNA)，L构型。（见图）环形双链DNA质粒分子的三种构型OCSCL不同质粒DNA分子量差异显著，最小的仅能编码2－3种蛋白质，分子量约为106，最大的可达108。基因克隆载体的质粒DNA分子，必定包括三种共同的组成部分，即复制基因、选择性记号和克隆位点。3、质粒DNA编码的表型质粒DNA仅占细胞染色体的1－3％，但却编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状，包括抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子及其它方面的特征，其中对抗菌素的抗性时质粒的最重要的编码特性之一。4、质粒DAN的复制类型严紧型质粒：每个寄主细胞仅含有1－3份的拷贝，称“严紧型”复制控制的质粒。松驰型质粒：每个寄主细胞中可高达10－60份的拷贝，称“松弛型”复制控制的质粒。质粒拷贝数：每个细菌染色体平均具有的质粒DNA分子的数目。质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并非绝对，它不仅受自身的制约，还受寄主的控制。质粒DNA拷贝数的控制高拷贝质粒DNA复制的启动，是由质粒编码基因合成的功能蛋白质调节的，与寄主细胞周期开始时合成的不稳定的复制起始蛋白质无关。低拷贝质粒的复制是受寄主细胞不稳定的蛋白质控制的，并与寄主细胞染色体同步进行。用蛋白质合成抑止剂氯霉素或壮观霉素处理寄主细胞，使染色体DNA复制受阻的情况下，松弛的质粒仍可继续扩增。而严紧型质粒则不行。5、质粒的不亲和性质粒的不亲和性又称不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一寄主细胞系中稳定共存的现象。质粒彼此之间是互不相容的，这样的质粒属于同一个不亲和群，如pMB1的派生质粒（或ColE1派生质粒）。彼此能够共存的亲和的质粒则是属于不同的不亲和群。属于同一不亲和群的质粒的亲缘关系上比较接近。6、质粒的其他特性稳定性：维持一定的拷贝数同源性：不同的质粒有相同的同源区重组性：质粒间、质粒同染色体间重组消除和恢复性等特性第二节质粒DNA的分离与纯化氯化铯密度梯度离心法碱变性法微量碱变性法影响质粒DNA产量的因素(1)寄主菌株的遗传背景(2)质粒的拷贝数及分子大小质粒作为基因克隆的载体分子，一个重要的条件是获得批量的纯化的质粒DNA分子。因而寄主细胞的裂解作用是分离质粒DNA的关键步骤。通常的裂解是加入溶菌酶或SDS使大肠杆菌细胞裂解。理想的状况是，使每个细胞都充分破裂到能使质粒DNA顺利溢出，而又没有污染过多的染色体DNA。1、氯化铯密度梯度离心法优点：可获得高纯度、高质量的质粒DNA。缺点：操作复杂；价格昂贵（氯化铯）；设备要求高（超速离心机）；易造成环境污染和人员伤害（溴化乙锭是一种极强的诱变剂）原理：是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间，在拓扑学上的差异发展出来的。加热或PH介于12.0-12.5的范围内，线性DNA会被变性，两条链会完全分开。而超螺旋DNA由于双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用，互补的两条链仍会紧密结合在一起，不会被变性。致冷或恢复中性PH值，变性处理的质粒和染色体DNA混合物便会迅速复性。共价闭合环状的质粒DAN，由于两条链在形体上仍保持在一起，复性迅速准确。随机断裂产生的线性的染色体DNA分子，互补链彼此已分开，复性就不会那么迅速而准确，它们聚集形成网状结构，通过离心会与变性的蛋白质及RNA沉淀下来。滞留在上清液中的质粒DAN则可通过乙醇沉淀法收集。2、碱裂解法分离纯化质粒DNA的程序3、微量碱变性法提取质粒DNA步骤离心收集细胞沉淀；细胞悬浮液重新悬浮细胞；裂解液使细胞裂解，释放出DNA，同时使DNA变性；中和液使线性质粒和染色体DAN复性；离心除去染色体DAN、蛋白质及RNA等复活物；含有质粒超螺旋DNA的上清液用酚臭提除去蛋白质；乙醇沉淀收集质粒DNA。4、影响质粒DNA产量的因素寄主菌株的遗传背景质粒的拷贝数及分子大小寄主菌株的生长条件培养基的类型等1）寄主菌株的遗传背景使用endA基因发生突变的(endAl)大肠杆菌寄主菌株，例如DH5,JM109endA基因突变，使大肠杆菌寄主细胞失去了合成具有功能活性的核酸内切酶I的能力，增进了质粒DNA分子的稳定性。所以从这类寄主细胞制备的质粒DNA质量有所改进，产量也得到了提高。2）质粒的拷贝数及分子大小细菌培养物中质粒DNA的理论产量是质粒拷贝数和分子量大小及每毫升培养物中大肠杆菌细胞总数三者乘积。一般认为，在37度培养条件下震荡16小时的大肠杆菌肉汤培养基，每毫升含有2×109细胞。质粒拷贝数的多寡是直接决定其DNA产量的重要因素；其次质粒分子大小也是决定DNA产量高低的重要因素，这点对重组质粒载体的影响尤为重要。第三节质粒载体的构建天然质粒用作克隆载体的局限性质粒载体必须具备的基本条件质粒载体的选择记号不同类型的质粒载体一、天然质粒用作克隆载体的局限性天然质粒有Co1E1、RSF2124和PSCl01等。PSC102天然质粒的局限性：如质粒的分子量较大，拷贝数较低，只有一个抗菌素抗性基因，无法使用插入失活技术选择重组体分子等。COLE1天然质粒具有高拷贝数，可以根据对大肠杆菌素E1的免疫性选择转化子，但这种筛选相当麻烦，影响它的使用。二、质粒载体必须具备的基本条件具有复制起点；具有可选择的标记；具有若干限制酶单一识别位点；具有较小的分子量和较高的拷贝数；作为表达载体还有启动子，转录转移信号，终止子序列等片段。三、质粒载体的选择记号在基因克隆中采用的质粒载体的选择记号，有新陈代谢特性、对大肠杆菌素E1的免疫性，抗菌素抗性等。使用抗菌素抗性记号有四环素抗性、氨苄青霉素抗性、链霉素抗性，卡那霉素抗性等。抗菌素抗性记号具有便于操作、易于选择的优点。四、不同类型的质粒载体高拷贝数的质粒载体低拷贝数的质粒载体失控的质粒载体插入失活型的质粒载体正选择的质粒载体表达型的质粒载体1、高拷贝数的质粒载体克隆的目的若仅仅是为了分离大量的高纯度的克隆基因的DNA片断，通常选择COLE1、PMB1或它们的派生质粒。这些质粒在没有蛋白质合成的条件下仍能继续复制。因此，若在处于对数生长晚期的含有COLE1一类质粒的大肠杆菌培养物中，加入适量的蛋白质抑制剂出来之后，经过10－12小时的培养，每个细胞中的质粒拷贝数可扩增到1000－3000个之多。2、低拷贝数的质粒载体低拷贝数的质粒载体，由于它们体积小、拷贝数低，与其相应的基因剂量也就较少，因此要制备大量的克隆DNA就很困难。低拷贝数的质粒载体在某些特定场合下有特殊用途。因为有些克隆的编码基因，当用高拷贝数质粒作载体时，其产物含量过高会严重地扰乱寄主细胞的正常新陈代谢活动。选用低拷贝数的质粒载体，可使其蛋白质产物对寄主细胞的毒害作用降低到最低的限度。3、失控的质粒载体有一些低拷贝数的质粒，其复制控制时温度敏感型的，即在不同的温度下，拷贝数会有显著的变化，这类质粒称失控的质粒载体。如PBEU1，在30度下，每个寄主细胞含适量的拷贝数，当超过35度，质粒的复制失去控制，在这种高温下，细胞的生长及蛋白质合成可按正常的速率持续2－3小时，这期间编码的质粒载体上的基因产物便超过了常量。最后，细胞生长收到抑制，并失去存活能力。4、插入失活型的质粒载体将外源DNA片断插入在会导致选择记号基因失活的位点，就有可能通过抗菌素抗性的筛选，提高获得阳性克隆的几率，这种质粒属于插入失活型质粒载体。在基因克隆筛选重组子时非常有用。5、正选择的质粒载体这种质粒载体具有直接选择记号，并可赋予寄主细胞相应的表型。通过选择具有这种表型特征的转化子，便可大大降低需要筛选的转化子的数量，提高选择的敏感性。使用正向选择质粒载体进行基因克隆是要受到一定的条件限制，它需要特殊的寄主菌株或选择培养基，而且存在这可使用的克隆位点少、假阳性水平高及不能调节插入序列表达活性等缺点。6、表达型的质粒载体外源基因（原核和真核基因）能够在大肠杆菌细胞或真核细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体特称为表达载体。典型的大肠杆菌表达型质粒载体主要组成包括：大肠杆菌的启动子及操纵位点序列、多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因。待表达的真核基因编码序列必须克隆在紧挨启动子下游的多克隆位点上，而且必须以其编码蛋白质氨基末端这一端靠近启动子的方向插入，才能在启动子控制下进行有效的转录。复制基因选择性标记多克隆位点基因克隆质粒载体的三种组成第四节重要的质粒载体一、大肠杆菌质粒载体pSCl01质粒载体Co1E1质粒载体pBR322质粒载体pUC质粒载体丧失迁移功能的质粒载体能在体外转录克隆基因的质粒载体1、pSCl01质粒载体pSCl01质粒作载体克隆非洲爪赡的基因2、CoLEl质粒载体3、pBR322质粒载体pBR322质粒载体的优点具有较小的分子量(4363bp）；（易于自身DNA的纯化，可以插入较大的外源DNA片断）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号（氨苄青霉素抗性基因ampr和四环素抗性基因ter）。具较高的拷贝数；而且经过氯霉素扩增后，每个细胞中可积累1000－3000个拷贝。pBR322质粒载体的结构来源pBR322质粒载体的形体图pBR322质粒载体tet基因的插入失活效应4、pUC质粒载体（1）pUC质粒载体的结构该类质粒是在pBR322质粒载体的基础上，族人一个在其5‘端带有一断多克隆位点的lacZ基因，而发展成为具有双功能检测特性的质粒载体系统。典型的pUC系列的质粒载体，包括四个组成部分：1)来自pBR322质粒的复制起点（ori);2)氨苄青霉素抗性基因（ampr),但失去了单识别位点；3)具有lacZ基因；4)位于lacZ基因的靠近5‘端的一段多克隆位点区段。pUCl8及PUCl9质粒载体的形体图(2)pUC质粒载体的优点具有更小的分子量和更高的拷贝数适用于组织化学方法检测重组体具有多克隆位点MCS区段5、能在体外转录克隆基因的质粒载体pSP64质粒载体的形体图6、穿梭质粒载体穿梭质粒载体(shuttleplasmidvector)，是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。穿梭质粒载体，有大肠杆菌—枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体，大肠杆菌—酿酒酵母穿梭质粒载体。二、酵母菌质粒载体酵母2µ质粒乳酸克鲁维酵母中的线性质粒大肠杆菌－酵母穿梭质粒酵母表达型质粒酵母分泌型表达质粒酵母人工染色体－YAC大肠杆菌—酿酒酵母穿梭质粒载体第六节质粒载体的稳定性