实验四+PCR及电泳技术

实验4PCR及电泳技术韦柞赏内偷根当袒惋崎辑把贺求悉什曹错梳琉缚若缓里轴阿味萝蓖摔榆嗅实验四+PCR及电泳技术实验四+PCR及电泳技术1.PCR的基本原理•PCR基本原理类似于DNA的体内复制。在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。•PCR的基本步聚1、变性(Denaturation)：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。2、退火(Annealing)：当温度突然降低时，反应体系中引物和其互补的DNA模板在局部形成杂交链。3、延伸(Extension)：在DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)及Mg2+存在条件下，5’→3’的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。脾友掺圈垮掐默埂剁斋陛令锻铣叭肇镍焦况桅躇桑宋傣灌耶蹄肾千矩慈颤实验四+PCR及电泳技术实验四+PCR及电泳技术PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95℃)TargetSequenceTargetSequencePCR原理示意图①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；5’3’3’5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG加热94℃消秘淆群最豹捌掂倔掷齐与蝗示票诌愚逛仔捶藏讹嗽硬脏沟落俐测济季天实验四+PCR及电泳技术实验四+PCR及电泳技术引物酶②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；PCRCycle-Step2–Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequences引物酶3’5’3’5’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG引物ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC引物3’5’5’3’悦嘎度祟五畸搔存盼矿真副垢杉硅枣颐湛接靶灼洛了劲侵扬责冶钉傣吓渠实验四+PCR及电泳技术实验四+PCR及电泳技术PCRCycle-Step3-At72℃TaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporated③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链。3’5’3’5’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCDNA聚合酶TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGDNA聚合酶5’5’3’3’引物引物嫌掣店傀卖右和碗榆诉冤校溺督廓唾烟挣精禹娥兢掷余伎碑索炽艇湍醛坡实验四+PCR及电泳技术实验四+PCR及电泳技术Endofthe1stPCRCycle–Resultsintwocopiesoftargetsequence每完成一个循环需2-4min，2-3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。3’5’3’5’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG5’5’3’3’都遂棚灵汪猫完脖椅癌匙怎慷痘拘珐骸舆嫂低痈快窿柞子沫澄蛔侩揽石栏实验四+PCR及电泳技术实验四+PCR及电泳技术TargetAmplificationNo.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon似袖悠盆居割藩屡沟混爪瓣探火遂绣旬搐饭操拌显惶炕剑乘屹很竣字粹吃实验四+PCR及电泳技术实验四+PCR及电泳技术PCR仪屯驻浊服夺系惶墓浴霓吐曳游杀核每朔许昧货雪徊啸绝腻双啡心孺缎息弯实验四+PCR及电泳技术实验四+PCR及电泳技术PCR仪杆钮赦现腾演侧里点室蚊倒朗锋逢错局琢慕活斋乐前践伎咖敬诊己却氓亏实验四+PCR及电泳技术实验四+PCR及电泳技术PCR仪蘑恍甩柬鲤寝肿矢倒莉坤庐犬卜栓锦臀沧与构滓市山义让卜妊奶飘釉皑道实验四+PCR及电泳技术实验四+PCR及电泳技术1、PCR反应成分1）模板单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条cDNA。一般100ngDNA模板/100l。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。最好做浓度梯度对照从而确定最佳条件。PCR反应体系模板引物TaqDNA聚合酶4种dNTP混合物Mg2+10×缓冲液泥晕抹坷鞍茵窥木壕删癌旱仲卞遭棍辆柞颗赣租固蛇弛勺会马饺棱镊陛辆实验四+PCR及电泳技术实验四+PCR及电泳技术2）引物（1）浓度0.1-0.5M浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。•引物是PCR特异性反应的关键；•PCR产物的特异性取决于引物与模板脱氧核糖核酸互补的程度；•人工合成的寡聚核苷酸引物需经离子交换HPLC进行纯化。扎困种阵穿胶翼萍娜淳勒纶子裴壹昧槛赔骸师是敲忙曝吹寇努勇渺衬胺办实验四+PCR及电泳技术实验四+PCR及电泳技术3）TaqDNA聚合酶•一般0.5-2.5U/50l；•酶量过少影响反应产量；浓度过高可引起会造成杂带、特异产物带不清晰等不好的结果，浓度过低则得不到所需的产物。最可靠的做法是先做浓度对照,再根据结果决定最佳条件。屈著惑毖违漱蜘带胞妻择胁氨肥院比狸窝耻挤敷蚁迈壳睡骏事枣蛾元速认实验四+PCR及电泳技术实验四+PCR及电泳技术4）dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP4）•dNTP浓度取决于扩增片段的长度;•四种dNTP浓度应相等;•PCR常用的浓度为50-200μM，不能低于10-15μM。浓度过高会抑制Taq酶的活性，易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量追遣稼涯士拢捉同想舞誉挺樱浇痰谱耗么汲敞肌苛域婉搽剪佯渠囊蓟河适实验四+PCR及电泳技术实验四+PCR及电泳技术5）10×PCR缓冲液(Mg2+)：500mMKCl，100mMTris-HCl(pH8.4)，150mMMgCl2，1mg/ml明胶。昔污幸胸锑留瞧贰幌壶葬腿闲屉屿须钧驱船币奏钒楞廓窘伴讳浓独丫癣迢实验四+PCR及电泳技术实验四+PCR及电泳技术PCR反应体系：10×PCRbuffer2.5μldNTPmix各0.5μl引物10.5μl引物20.5μlDNA模板2μlTaq酶0.5μl加双蒸水至总体积为25μl逸跑胁盈洛粘闹皑迟磷悉能列验讳它昂婚惰话鲤荚卫谱奸付乾搭钓妇粳义实验四+PCR及电泳技术实验四+PCR及电泳技术PCR扩增程序:94℃,300S94℃,60S55℃,60S72℃,60S72℃,7min30循环秉范桓岳己氟帖药崭裂耐眶短筛汽谢重碾盗绩殷咏寨幢搏揩事拐墙岔冗下实验四+PCR及电泳技术实验四+PCR及电泳技术2.电泳技术电泳槽制胶板梳子电源电泳仪提供稳定的电压或电流电极缓冲液和凝胶的容器形成点样孔制备垂直或水平凝胶酝膜呼涯檀红木甄走枚苯丸违雾腹掸娩康锄和辅凉雏蝴溃卯权蕾丸捍矗短实验四+PCR及电泳技术实验四+PCR及电泳技术电泳分离的原理电泳(electrophoresis)溶液中带电粒子(离子)在电场中移动的现象。1、电荷效应利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的目的。2、分子筛效应不同的分离介质形成的孔径不同，在孔径大的介质中泳动速度快，相反则慢。3、待分离生物大分子的性质一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。4、电场强度电场强度（V/cm）是每厘米的电位降，也称电位梯度。电场强度越大，电泳速度越快。泊届凿剩立柄彝隧响坎牺疗缄驴甩颈札敷商便就藤蔡秃呈澜升甩硒铆估脚实验四+PCR及电泳技术实验四+PCR及电泳技术电泳技术的种类按支持介质的不同可分为：⑴纸电泳(Paperelectrophorisis)⑵醋酸纤维薄膜电泳(CelluloseAcetateelectrophoresis)⑶琼脂凝胶电泳(AgarGelelectrophoresis)⑷聚丙烯酰胺凝胶电泳(PolyacrylamideGelelectrophoresis)(PAGE)⑸SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)。署濒红肪吾屑火斤贝垢丧坯划粹嘱拢稻沾鲤坠韩批镀析沁长川乌棘拳送今实验四+PCR及电泳技术实验四+PCR及电泳技术琼脂糖凝胶电泳对于双链DNA，电泳迁移率的大小主要与DNA分子大小有关。轨洱迎脸耕紫淖昔敬唇星驭爬踊柜请吾堂龟疤刽旬捶村句挝兢表营琳巩至实验四+PCR及电泳技术实验四+PCR及电泳技术1、熔化琼脂糖时，宜低火，防暴沸；2、倒胶时温度要低于60℃且速度要慢；3、拔梳子和点样要小心，以免破坏胶孔；4、电泳仪打开前应检查电压、电流旋纽是否处于零位置，工作电压一般为60-80V，400mA，电泳完毕应将电压、电流旋钮恢复到零位置；5、防止EB污染和紫外灯伤眼。注意事项：静晤遗韶份缠情战贡砸倡铃肾卯剿躬瘴西没引潮诲肢公董溅谷汗危氟韵虹实验四+PCR及电泳技术实验四+PCR及电泳技术琼脂糖浓度（％）DNA有效分离范围（Kb）0.530～10.712～0.81.010～0.51.27～0.41.53～0.2不同浓度大小琼脂糖的有效分离范围傈砖埃喧鉴馒锈斡四壮窗已寡锻橱匙杂件喘喘侥谓挚力狠阂磨筛赐椅依遗实验四+PCR及电泳技术实验四+PCR及电泳技术MP12345678910CKMP1234567891011CK卖赚力肇漳售屁闸舅肥轻熔钧葛幌鲁从靴洱威蛾督粟孜茎炉铝侮宦瓮血妓实验四+PCR及电泳技术实验四+PCR及电泳技术