研究生毕业论文答辩分析

导师：向晓星副教授主任医师研究生：刘国芳结直肠癌患者外周血CD4+T细胞亚群的表达及临床意义提纲选题背景1实验目的2技术路线3实验内容和方法4结果5结论6选题背景概述：结直肠癌（colorectalcarcinoma,CRC）为最常见恶性肿瘤之一，目前主要治疗手段是采用包括手术在内的综合治疗，研究表明，免疫细胞的相互作用影响结直肠癌患者的临床进展和治疗效果，CD4+T细胞介导的适当的免疫应答在控制恶性肿瘤中发挥重要的作用。.选题背景原始CD4+Th1Th2Th9Th17Th22TregIFN-γIL-4IL-9、IL10IL-17、IL-21、IL-22IL-22TGF-β、IL-10主要介导细胞免疫和清除胞内病原微生物主要介导体液免疫和清除胞外病原微生物参与抗寄生虫感染、哮喘等过敏性疾病和自身免疫性疾病的发病对抗胞外病原菌的感染，参与自身免疫性疾病和肿瘤的发病参与炎性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤的发病主要参与自身免疫耐受的维持和自身免疫性疾病及肿瘤的发病选题背景作用机制IL-22可通过活化STAT信号通路，促进恶性肿瘤的生长和转移Treg细胞可抑制宿主的抗肿瘤免疫应答在肿瘤微环境中，Th17细胞和Treg细胞可相互转化，抑制Th17细胞产生可促进Treg细胞发育的细胞因子，Th17细胞与Treg细胞的分化可能存在相互抑制Th17细胞可以通过促进血管生成因子的生成发挥促肿瘤免疫，也可以通过促进CD8+T细胞活性发挥抗肿瘤效应选题背景Th22细胞是新发现的一类CD4+T细胞亚群，主要表达IL-22，Th22细胞参与自身免疫性疾病和炎性疾病的发病，最近研究发现，在消化系统、呼吸系统及血液系统等多个系统的常见肿瘤的外周血和肿瘤组织中发现Th22细胞及其相关细胞因子IL-22的存在。研究发现在多种肿瘤，如肝癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、肠癌中均发现Th17和Treg细胞及其细胞因子的存在。Th17/Treg失衡与肿瘤免疫是近年来研究的热点。选题背景。Liu等研究小组发现，与健康对照组相比，胃癌患者术前外周血中Th17、Th22细胞水平明显增高，与胃癌TNM分期有关，同时发现Th22细胞水平与胃癌患者总体生存率成反比。Zhang等研究小组发现Th22细胞在肿瘤组织中的比例显著高于其他组织（包括肿瘤引流淋巴结、自体的非肿瘤组织和癌旁组织），并与肿瘤的分期呈正相关。同时发现Th22细胞表达水平高的患者21个月生存率显著降低。Maruyama等研究胃癌患者肿瘤微环境中Th17细胞及Treg细胞时发现，Th17细胞及Treg细胞在免疫早期出现积聚，随着肿瘤的进展，Treg细胞数量逐渐增加，而Th17细胞逐渐减少。Liu,etal.IncreasedintratumoralIL-22-producingCD4+TcellsandTh22cellscorrelatewithgastriccancerprogressionandpredictpoorpatientsurvival.Zhang,etal.IncreasedCirculatingTh22andTh17CellsareAssociatedwithTumorProgressionandPatientSurvivalinHumanGastricCancer.MaruyamaT,etal.DistributionofTh17cellsandFoxP3+regulatoryTcellsintumor-infiltratinglymphocytes,tumor-draininglymphnodesandperipheralbloodlymphocytesinpatientswithgastriccancer选题背景实验目的检检测结直肠癌患者外周血Th1、Th17、Th22和Treg细胞的表达水平初步分析探讨Th1、Th17、Th22和Treg细胞与CRC临床分期的关系及在CRC发病机制中的可能作用结直肠癌患者术前外周血（33例）健康对照组（25例）分析细胞在外周血中的表达探讨Th1、Th17、Th22、Treg细胞的表达与肿瘤临床病理特征的关系流式检测外周血Th1、Th17、Th22、Treg细胞技术路线实验内容标本来源：2013年2月至2013年12月，苏北人民医院收治的结直肠癌患者33例，根据CRCDukes分期将33例CRC患者分为两组：早期CRC组DukesA期（n=17）和进展期CRC组DukesB+C+D期（n=16）;所有患者均未接受手术、放化疗及其他抗肿瘤治疗；经术后病理学诊断为原发性结直肠癌；选择同期健康体检者25例作为对照（对照组），实验组和对照组均排除其他自身免疫性疾病，HIV或梅毒感染。标本采集：分别取CRC患者（术前）和对照者肝素钠抗凝静脉血实验内容肝素钠抗凝静脉血流式细胞术检测Th1、Th17、Th22细胞100ul抗凝血1640液稀释刺激加一抗固定、破膜加二抗孵育、洗涤上机检测流式细胞术检测Treg细胞50ul抗凝血孵育洗涤加溶血素加一抗上机检测实验内容结果判定CD3+CD8-IL-17-IFN-γ+T细胞CD3+CD8-IFN-γ-IL-17+T细胞CD3+CD8-IFN-γ-IL-17-IL-22+T细胞Th1Th17Th22TregCD4+CD25highCD127lowT细胞分析结果采用统计学软件Graphpadprism5和SPSS17.0进行统计学分析，计量资料数据均以均数±标准差表示，Treg和Th17细胞的相关性分析用Pearson相关分析，两组数据比较选择t检验，p0.05为差异有统计学意义,p0.01为差异有显著统计学意义。实验结果1、CRC患者外周血中Th1细胞/CD4+T淋巴细胞的比例正常对照组CRC组0204060————————p0.05Th1细胞（%）正常对照组CRC早期CRC进展期0204060——————————————————p0.05p0.05p0.05Th1细胞（%）图1-1CRC患者及正常对照组外周血Th1细胞/CD4+T细胞比例比较图1-2正常对照组、CRC早期组、CRC进展期组Th1细胞表达水平比较2、CRC患者外周血中Th17细胞/CD4+T淋巴细胞的比例实验结果正常对照组CRC组0.00.51.01.52.02.5————————p0.01Th17细胞（%）正常对照组CRC早期CRC进展期0.00.51.01.52.02.5——————————————————p0.01p0.01p0.05Th17细胞（%）图1-3CRC患者及正常对照组外周血Th17细胞/CD4+T细胞比例比较图1-4正常对照组、CRC早期组、CRC进展期组Th17细胞表达水平比较实验结果3、CRC患者外周血中Th22细胞/CD4+T淋巴细胞的比例正常对照组CRC组012345————————p0.01Th22细胞（%）正常对照组CRC早期CRC进展期012345——————————————————p0.05p0.05p0.01Th22细胞（%）图1-5CRC患者及正常对照组外周血Th22细胞/CD4+T细胞比例比较图1-6正常对照组、CRC早期组、CRC进展期组Th22细胞表达水平比较实验结果4、CRC患者外周血中CD4+CD25highCD127lowTreg/CD4+T淋巴细胞的比例正常对照组CRC组051015————————p0.01Treg细胞（%）正常对照组CRC早期CRC进展期051015———————————————————p0.05p0.05p0.01Treg细胞（%）图1-7CRC患者及正常对照组外周血Treg细胞/CD4+T细胞比例比较图1-8正常对照组、CRC早期组、CRC进展期组Treg细胞表达水平比较实验结果CRC组外周血中Th17/Treg的比值明显高于健康对照组；早期CRC组外周血中Th17/Treg的比值明显高于健康对照组；进展期CRC组外周血中Th17/Treg的比值低于早期CRC组，差异有统计学意义。5、CRC患者外周血中Th17/Treg的比值实验结果6、Th17细胞与Treg细胞的相关性00.20.40.60.811.2051015Treg细胞（%）Th17细胞（%）系列100.511.522.5051015Treg细胞（%）Th17细胞（%）系列1图2-3正常对照组（r=0.51，P=0.011）图2-4CRC组（r=0.337，P=0.056）实验结果注：Q1-1：CD3+CD8-IL-17-IFN-γ+T细胞Th1细胞，Q4-1：CD3+CD8-IFN-γ-IL-17+T细胞Th17细胞，Q1：CD3+CD8-IFN-γ-IL-17-IL-22+T细胞Th22细胞图2-1Th1、Th17、Th22细胞亚群比例流式图IL-17GatedonCD3+CD8-IFN-rIL-22正常对照组早期CRC组进展期CRC组实验结果注：P3：CD4+CD25highCD127lowTTreg细胞图2-2Treg细胞亚群比例流式图CD4PerCPCD25FITCCD127PE-ACD25FITC正常对照组早期CRC组进展期CRC组实验结果表2各组外周血Th1、Th17、Th22及Treg细胞比例组别例数Th1（%）Th17（%）Th22（%）Treg（%）CRC组3329.84±8.61.01±0.3a2.36±0.9a9.25±1.5a早期CRC组1728.74±9.61.12±0.5a1.91±0.538.66±1.5a进展期CRC组1631.00±7.50.88±0.4a2.61±0.78a9.88±1.3ab对照组2527.38±6.50.56±0.41.58±0.77.60±1.7注：a与对照组比较，p0.05；b与早期CRC组比较，p0.05；结论第三、健康人中Th17与Treg呈正相关性，而在CRC患者中无相关性。可见Th17/Treg在正常人中处于平衡状态，而在CRC患者中被打破，能否通过纠正Th17/Treg的失衡来抑制恶性肿瘤的生长和转移还有待于进一步的研究证实。这可为CRC的治疗提供一个新的思路。第二、Treg细胞随着肿瘤进展逐渐增高，而Th17细胞则随着肿瘤进展逐渐降低，最终导致Th17/Treg比值的失衡。第一、Th17、Th22、Treg在CRC患者外周血中高表达，且与CRC患者Dukes分期有关。这说明Th17、Th22、Treg参与结直肠癌的发生发展。攻读学位期间完成的论文•GuofangLiu,XiaoxingXiang,DongTangetal.S-1combinationtherapyversusS-1monotherapyinadvancedgastriccancer:ameta-analysis[J].WorldJournalofGastroenterology,2014,20(1):310-318.•刘国芳，向晓星.Th9细胞及其与炎性疾病关系的研究进展[J].医学综述，2013,19(6):1009-1011.•刘国芳，向晓星.Th22细胞及IL-22在肿瘤中的作用[J].国际肿瘤学杂志，2014,41（2）：93-96.•刘国芳，向晓星.食管静脉曲张破裂出血的急诊治疗进展[J].临床肝胆病杂志，2014，30(7):278-282.•刘国芳，向晓星.结直肠癌患者外周血CD4+T细胞亚群的检测及临床意义《中华肿瘤杂志》（审稿中）致谢衷心感谢我的导师向晓星教授，为我指明了学习和科研的方向，感谢血液研究所马莉老师在流式细胞检测方面给予的帮助，感谢苏北医院胃肠外科所有的医护人员，在我收集标本时给予的支持与帮助，感谢消化内科所有老师在临床学习中给予我的指导。最后衷心的感谢我的父母、家人和朋友多年来默默的奉献和支持，感谢你们！希望各位专家提出宝贵意见