第二节 聚合酶链式反应

第二节聚合酶链式反应PolymerasechainreactionPCRContentofTable一、PCR的定义二、PCR技术的优点三、PCR原理四、PCR的标准反应体系五、PCR反应五要素六、PCR类型及应用一、PCR的定义在引物指导下由酶催化的对特定克隆或基因组DNA序列进行的体外扩增反应。PCR技术的创建Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。KaryB.Mullis（1944－）二、PCR技术的优点•特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等•能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍三、PCR原理Sample1.denaturatation2.Primerannealing3.PrimerextensionRegiontobecopiedPCR技术原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。模板DNA变性：加热至94℃左右，双链DNA解离成单链；模板DNA与引物的退火(复性)：55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：在TaqDNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的双链；重复循环变性--退火--延伸三过程，使DNA扩增量呈指数上升。目录PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C1234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增PCRproductTargetAmplificationNo.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128AmpliconPCR仪四、PCR的标准反应体系•10×扩增缓冲液10μl4种dNTP混合物各200μmol/L引物10～100pmol模板DNA0.1～2μgTaqDNA聚合酶2.5ul（Mg2+）1.5mmol/L加双或三蒸水至100ulHome五、PCR反应五要素•引物（primer）•酶（TaqDNApolymerase）•dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）•模板（template）•Mg2+（magnesium）六、PCR的类型及应用1、PCR的类型反转录PCR技术：RNA的反转录与PCR的联合应用原位PCR技术：在细胞内进行，不需要提取DNA实时PCR技术：进行DNA的定量分析筑巢PCR彩色PCR多重PCR不对称PCR共享引物PCR差异显示PCR锚定PCR重组PCR2、PCR的应用•研究-基因克隆、测序、分析突变•诊断-细菌、病毒、寄生虫检测、诊断•人类基因组工程-遗传图谱的构建、测序、表达图谱•法医-犯罪现场标本分析•肿瘤检测•其他……法医学个人识别、亲子鉴定1985年，英国遗传学家Jeffreys采用DNA指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。有时犯罪物证量很少，不足以用来进行DNA指纹分析，PCR有效解决这些问题。对于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一根毛发、一滴血等都可用于分析，在法医学上认证罪犯、亲子鉴定以及人的性别鉴定中PCR技术被普遍采用。什么是“DNA指纹技术”？•世界上除同卵双生外，几乎没有指纹一模一样的两个人，所以指纹可以用来鉴别身份。•研究表明，每个人的DNA都不完全相同，因此，DNA也可以像指纹一样用来识别身份，科学家经过特殊处理后会显示某种“图案”，看上去好像黑白相间的条形码，这种方法就是DNA指纹技术。父’父子母现嫌1嫌2嫌3