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实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法一、实验目的掌握还原糖和总糖测定的基本原理,学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类,单糖都是还原糖,双糖和多糖不一定是还原糖,其中乳糖和麦芽糖是还原糖,蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同,可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来,对没有还原性的双糖和多糖,可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定,再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(还原糖以葡萄糖含量计)。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物,3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系,利用分光光度计,在540nm波长下测定光密度值,查对标准曲线并计算,便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时,每断裂一个糖苷键需加入一分子水,所以在计算多糖含量时应乘以0.9。三、实验材料、主要仪器和试剂1.实验材料小麦面粉;广范pH试纸。2.主要仪器(1)大试管:2×20cm×14(2)烧杯:100mL×3(3)三角瓶:100mL×1(4)容量瓶:100mL×3(5)移液管:1mL×3;2mL×2;10mL×4(6)吸耳球、玻璃棒(7)恒温水浴锅(8)漏斗、滤纸(9)白瓷缸、电炉(10)精度天平(11)分光光度计3.试剂(已制备)(1)1mg/mL葡萄糖标准液准确称取90℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg,置于小烧杯中,加少量蒸馏水溶解后,转移到100mL容量瓶中,用蒸馏水定容至100mL,混匀,4℃冰箱中保存备用。(2)3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂将6.3g3,5-二硝基水杨酸(DNS)和2mol\LNaOH溶液262mL,加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中,再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠,搅拌溶解,冷却后加蒸馏水定容至1000mL,贮于棕色瓶中,7-10天后才能使用。(3)6mol/LHCl和6mol/LNaOH。四、操作步骤1.制作葡萄糖标准曲线取7支2×20cm大试管编号,按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂,配成不同葡萄糖含量的反应液。表1葡萄糖标准曲线制作管号葡萄糖含量(mg)1mg/mL葡萄糖标准液(mL)蒸馏水(mL)DNS(mL)吸光度值(A540)00021.510.20.21.81.520.40.41.61.530.60.61.41.540.80.81.21.551.01.01.01.561.21.20.81.5将各管摇匀,在沸水浴中准确加热5min,取出,用流动水冷却至室温,用蒸馏水补充至20mL(即各加入16.5mL蒸馏水),震荡混匀,在分光光度计上进行比色。调波长540nm,用0号管调零点,测出1~6号管的吸光度值。以吸光度值为纵坐标,葡萄糖含量(mg)为横坐标,在坐标纸上绘出标准曲线。2.样品中还原糖和总糖的测定(1)还原糖的提取准确称取3.00g食用面粉,放入100mL烧杯中,先用少量蒸馏水调成糊状,然后加入50mL蒸馏水,搅匀,置于50℃恒温水浴中保温20min,使还原糖浸出。将浸出液用100mL容量瓶定容,混匀,过滤,滤液作为还原糖提取液,待测。(2)总糖的水解和提取准确称取1.00g食用面粉,放入100mL三角瓶中,加15mL蒸馏水及10mL6mol/LHCl,置沸水浴中加热水解30min。待三角瓶中的水解液冷却后,用6mol/LNaOH中和(大约10mL左右),用广范pH试纸测试中和到pH=7,用蒸馏水定容在100mL容量瓶中,混匀。将定容后的水解液过滤,取滤液1mL,移入另一9mL水的试管中,混匀,稀释10倍作为总糖待测液。(3)显色和比色取7支2×20cm大试管,编号,按表2所示分别加入待测液和显色剂,用7号管进行空白调零。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。表2样品还原糖测定管号还原糖待测液(mL)总糖待测液(mL)蒸馏水(mL)DNS(mL)吸光度值(A540)查曲线葡萄糖量(mg)72.01.581.01.01.591.01.01.5101.01.01.5111.01.01.5121.01.01.5131.01.01.5五、结果与计算:利用8、9、10号管吸光度值和11、12、13管吸光度值,在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数,分别计算出还原糖和总糖的平均值,按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。六、注意事项1.试管、烧杯和三角瓶事先要洗净烘干。2.试管要提前标号。3.移液管使用前要润洗。4.移液管要专管专用。5.分光光度计要预热30分钟。6.比色皿要用擦镜纸擦干,尤其是光滑面,更不能用手碰。7.保持环境干净,废液倒在废液缸中,废纸放入垃圾桶中。8.标准曲线制作与样品测定尽量同时进行显色,并使用同一参比溶液调零点和比色。9.用分光光度计比色时,应注意每次都应该把比色皿用蒸馏水洗两遍,再用待测液润洗,之后再装待测液。七、思考题1.3,5-二硝基水杨酸比色法是如何对总糖进行测定的?2.比色测定时为什么要设计空白管?八、预习题1.什么是还原性糖2.高中学过测定还原性糖的方法是什么?其原理和操作又是什么?3.操作注意:注意事项中要求,用分光光度计比色时,每次都应该把比色皿用蒸馏水洗两遍,这是为什么?如果不洗会造成什么影响?还原糖(%)=查曲线所得还原糖毫克数×稀释倍数×100样品毫克数总糖(%)=查曲线所得总糖水解后毫克数×稀释倍数×0.9×100样品毫克数
本文标题:实验一,3,5-二硝基水杨酸比色法-还原糖和总糖的测定
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