基因工程制药

基因工程制药2013-5-87基础知识目录简介地位，意义，优势发展简史发展阶段，国内外研究进展步骤流程，工具实例阿尔兹海默症2013-5-8前沿8基因工程制药的地位-1生物技术以生命科学为基础，利用生物体（或生物组织、细胞及其组分）的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系，并与工程相结合，利用这样的新物种（或品系）进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性的技术体系。（食品，添加剂，化妆品，制药。。。。）生物技术制药采用现代生物技术，按照人的设想，借助动植物微生物来生产所需的医药品。发酵，抗体制药，酶工程，动物/植物细胞工程，基因工程基因工程制药（geneticengineeringpharmaceutics）利用基因重组技术将外源基因导入宿主菌或细胞，进行大规模培养，以获得蛋白质药物的过程。2013-5-89基因工程制药的地位-2生物技术以生命科学为基础，利用生物体（或生物组织、细胞及其组分）的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系，并与工程相结合，利用这样的新物种（或品系）进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性的技术体系。基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、生化工程有意识地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。基因工程制药（geneticengineeringpharmaceutics）利用基因重组技术将外源基因导入宿主菌或细胞，进行大规模培养，以获得蛋白质药物的过程。（最上游的技术，占主导地位。）2013-5-810基因工程制药的意义DNA重组技术出现以前，大多数人用蛋白质药物从血液、尿液和动物的组织和器官中提取成本高，产率、产量低，供应有限，易被某些病原体污染，存在不安全因素。伦理道德（活熊取胆，蜈蚣）应用基因工程技术可十分方便且有效地解决上述提到的问题从极端复杂的机体细胞内获取所需的基因，将其在体外进行剪切、拼接，使其重新组合，然后转入适当的细胞进行表达，从而生产出比原来多数百、数千倍的相应的蛋白质从量、质上都可以得到改进，且可以创造全新物质2013-5-811基因技术与传统技术比较5mg生长激素释放抑制因子传统技术：需要50万头的绵羊脑基因工程技术：9L细菌发酵液1ug白细胞干扰素传统技术：需要2L人血基因工程技术：1L基因工程菌发酵液可生产600ug10g胰岛素传统技术：需要450kg猪胰脏基因工程技术：200L细菌培养液基因工程制药的优势最大的成就：用于生物治疗的新型生物药物的研制。优点：可大量生产过去难以获得的生理活性物质可发现、改造内源性生理活性物质可获得新型化合物，扩大药物筛选来源2013-5-813基因工程制药发展简史基因工程药物发展分为3个阶段:（一）细菌基因工程即把目的基因通过适当重组后导入如大肠杆菌等微生物内构建工程菌，再通过它们来表达目的基因。缺点：1、细菌为低等生物，构建好的哺乳动物乃至人类的基因导入细菌，往往不能表达、不能修饰（糖基化）2、即使表达了人类基因，往往没有生物活性或活性不高基因工程制药发展简史（二）细胞基因工程把人或哺乳动物的基因直接导入哺乳动物的细胞中，生产有生物活性的产品。优点：表达哺乳动物乃至人类的基因缺点：培养要求的条件苛刻，成本太高基因工程制药发展简史（三）转基因动物及转基因植物将所需要的目的基因直接导入哺乳动物体内（鼠、兔、羊、牛、猪）或导入可食用植物体内（番茄，黄瓜，马铃薯），使目的基因在哺乳动物及可食性植物内表达，从而获得目的基因产品。具有柠檬味的西红柿曾培育出世界上第一只克隆羊“多利”的英国罗斯林研究所，成功培育出世界上第一批能下“神奇鸡蛋”的小鸡。这种经过基因改造的小鸡所下的蛋能用来制造治疗癌症和其他疾病的药物。这种法国品种鸡每年可下约300颗鸡蛋，经过基因改造后的鸡，其DNA中含有人为加入的人类基因，当母鸡生下蛋后，科学家就能从鸡蛋的蛋白中提取用来制造药物的蛋白质。牛津生物医药公司的研究人员安德鲁-伍德表示：“从理论上来说，这种技术适用于不同种类的基因，因此这些母鸡也可以被用于制造许多不同的蛋白质。未来，这种技术有望用于治疗包括帕金森症、糖尿病和多种癌症在内的各种疾病。”动物疫苗、生长激素等例：从转基因羊的羊奶中提取出治疗心脏病的药物tPA2013-5-823基因工程药物的种类一、细胞因子类1、干扰素类：具有抗病毒活性的蛋白2、白细胞介素：IL-2，IL-3,IL-43、集落刺激因子类：促进造血细胞增殖和分化，GM-GCSF,G-CSF,M-CSF4、生长因子类：对不同细胞生长有促进作用的蛋白质5、趋化因子类：对噬中性粒细胞或特定的淋巴细胞等炎性细胞有趋化作用的一类小分子6、肿瘤坏死因子类：抑制肿瘤细胞生长、促进细胞凋亡的蛋白质二、激素类如胰岛素、生长激素、心素纳、人促肾上腺皮质激素三、治疗心血管及血液疾病的活性蛋白类1、溶解血栓类尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂。2、凝血因子类3、生长因子类促红细胞生成素EPO，血小板生成素TPO，血管内皮生长因子4、血液制品血红蛋白，白蛋白四、治疗和营养神经的活性蛋白类神经生长因子，脑源性神经生长因子，睫状神经生长因子，神经营养素3，神经营养素4五、可溶性细胞因子受体类白细胞介素1受体、白细胞介素2受体、TNF受体、补体受体等六、导向毒素类1、细胞因子导向毒素2、单克隆抗体导向毒素●目前已研制成功约200多种基因工程药物和疫苗，其中销售较大的是红细胞生成素（EPO)、人胰岛素（insulin)等。●2009年，全球生物药物的销售额为1240亿USD,而小分子药物的市值为4110亿USD。●到2014年，全球小分子药物的市值仅为170亿USD,全球制药行业战略转移，越来越集中于生物药物的开发和研制。●到2014年，全球50强制药企业将会有36家出现在单抗、治疗性蛋白和疫苗市场中。我国生物技术制药现状和发展前景开始于20世纪70年代初，先是进行固定化酶的研究，以后固定化酶和固定化细胞的研究与应用得到发展70年代后期，开始跟踪国外基因工程技术的某些基础性工作80年代初期，开始乙型肝炎基因工程疫苗、基因工程干扰素的研究，生物技术方面的项目得到了国家的支持，其中-1b型干扰素为我国首创目前我国已批准12种基因工程药物和疫苗上市，在研究开发中的也有10余种。起步较晚，基础较差•目前我国生物制药技术申报貌似“活跃”，实际上都是在围绕仅有的几个老品种进行改进或改制，完全创新技术很少。•与发达国家相比，我国生物技术实验室技术差距不大，但在产业化方面与世界的差距正在逐渐加大：当今世界有20多种畅销生物药时，我国能生产10种；而现在世界上有140多种时，我国却只能生产20多种•由于我国医药生物技术成果缺乏自主知识产权，而目前我国生物制药公司中技术和产业发展比较成熟的也仅有北京天坛生物、深圳康泰生物、深圳科兴、长春金赛等少数几家企业，产业规模较小；而一些传统型的制药企业由于受技术条件等影响而难以迅速进入生物制药领域。基因工程制药基本知识工具酶限制性内切酶DNA聚合酶DNA连接酶载体质粒-噬菌体、黏粒、M13噬菌体、噬菌粒和病毒受体细胞2013-5-832限制酶的发现1978年诺贝尔生理医学奖WernerArber瑞士Biozentrum大學1929年--DanielNathans美國霍普金斯大學醫學院1928年--1999年HamiltonO.Smith美國霍普金斯大學醫學院1931年--基因的剪刀——限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA分布：主要在微生物中。特点：特异性，即识别特定核苷酸序列并切割特定切点。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA分子切断。目前已发现的限制酶有200多种。粘性末端：限制酶错位切断DNA双链而形成的具有彼此互补碱基的单链延伸末端。平整末端：限制酶在同一位点平齐切断DNA两条链而形成的双链末端。同尾酶：来源各异的限制酶识别的靶子序列各不相同，但都产生相同的粘性末端。2013-5-835•基因的针线——DNA连接酶DNA连接酶能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将两条DNA分子拼接起来3种情况：1.缺口DNA2.平末端DNA3.粘性末端DNA……GG……生物A基因片段……GAATTC…………CTTAAG……生物B基因片段……GAATTC…………GAATTC…………CTTAAG…………CTTAAG……同一种EcoRⅠ酶切……GAATTC…………GAATTC……AATTC…………CTTAAG…………CTTAA……CTTAAG……不同来源的DNA片段混合……GAATTC…………GAATTC…………CTTAAG…………CTTAAG……将不同种来源的DNA片段连接起来DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ1.5´3´的聚合酶活性2.5´3´的核酸外切酶活性3.3´5´的核酸外切酶活性间形成磷酸二酯键1)只能将单个核苷酸连1)在两个DNA片段之接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键2)以一条DNA链为模板，2)将DNA双链上的两区别2将单个核苷酸通过磷酸个缺口同时连接起来，二酯键连接成一条互补不需要模板的DNA链形成磷酸二酯键把一个目的DNA片段通过重组DNA技术载送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具。载体的本质是DNA，能在宿主细胞中进行自我复制和表达。作用：将外源基因送入受体细胞。条件：（1）能在宿主细胞内复制并稳定地保存。（2）具有多个限制酶切点。（3）具有某些标记基因种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。质粒载体质粒：是一些存在于微生物细胞内染色体外的小型闭合环状双链DNA分子，是能够进行独立复制并保持恒定遗传的复制子。质粒是基因工程中一类主要的克隆载体•基因克隆常用的载体：质粒有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的有切割位点培养基鉴别能复制并带着插入的目的基因一起复制质粒载体pUC质粒载体pBR322质粒载体pBR322的结构1.氨苄青霉素抗性基因（Ampr）2.四环素抗性基因（Tetr）3.DNA复制起点（ori）优越性具有更小的分子质量和更高的拷贝数适合于用组织化学方法检测重组体具有多克隆位点MCS区段噬菌体噬菌体：是“捕食”细菌的生物，是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的细菌病毒的总称。一旦离开了宿主细胞，噬菌体既不能生长，也不能复制。噬菌体侵染细胞三个阶段感染阶段增殖阶段成熟阶段T2噬菌体在37℃下大约只需四十分就可以产生100～300个子代噬菌体。噬菌体只含有蛋白质和DNA。常用的λ噬菌体载体1.λgt系列载体（1）λgt10载体（2）λgt11载体·基因的目的地——受体细胞大肠杆菌酵母棉花昆虫哺乳动物基因工程药物生产的技术定义：基因工程技术是指将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达。基因工程药物制造的一般流程：（1）获得目的基因；（2）组建重组质粒；（3）构建基因工程菌；（4）培养工程菌；（5）产物分离纯化；（6）除菌过滤；（7）半成品检定；（8）包装上游阶段下游阶段上游：主要指的是目的基因分离、工程菌（或细胞）构建。上游阶段的工作主要在实验室内完成；下游：主要指的是从工程菌（或细胞）的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量控制等，将实验室成果产业化、商品化.一、基因工程药物生产的上游技术上游技术：•获得目的基因•用限制性内切酶和连接酶将其插入适当的载体质粒或噬菌体中•转入大肠杆菌或其它宿主菌（细胞），以便大量复制目的基因。•选择基因表达系统主要考虑的是保证表达功能，其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易。(一)目的基因的获得建立一个特定的基因无性繁殖体系—基因工程株，首先要获得该基因，并通过克隆扩增，这种基因即目的基因，对宿主细胞DNA而言，又称为外源基因或外源DNA。目的基因来源原核细胞：原核生物基因组较简单，较易获