5 第四章 兽医生物制品生产的基本技术

第四章兽医生物制品生产的基本技术第一节菌种与毒种选育技术生产用菌种和毒种是兽医生物制品生产的关键，也是生物制品质量的直接保证。由于生物制品用途的不同，所选择的菌种和毒种也各异，有的致病力强、抗原性好的，有的则要求致病力弱或仅有感染性而无病害性，免疫原性高的菌（毒）种。菌种和毒种筛选的基本原则是：根据所生产的制品的用途、使用方法、使用方式、生产过程和条件等因素，从细菌和病毒的安全性、免疫原性、遗传稳定性及生产实用性等方面，进行评价和筛选。一、兽医生物制品菌（毒）种标准1．生物学特性明显、历史清楚：菌种的形态、培养特征、生化特性及血清免疫学特性明显，易于鉴别；菌（毒）种人工感染动物引起稳定一致的临床症状和病理变化特征。原始细菌或病毒株的来源地区、动物品种和流行资料应清楚；分离鉴定资料完整；传代、保藏和生物学特性检查方法明确。2．遗传学上相对纯一与稳定：菌（毒）种是一个相对群体，在传代增殖过程中受不同因素的作用后会发生遗传性状的改变或分离,因此要求生物制品用菌（毒）的这种改变或分离越小越好。菌（毒）种遗传性状的改变主要表现在形态特征、毒力和反应原性、免疫原性等方面。为提高或保持菌（毒）种纯一性和稳定性，应经常进行挑选，纯化或克隆化，例如羊痘鸡胚化毒种在经过羊体传代2~4代复壮和纯化后方能用于制造疫苗。3．免疫原性与反应原性优良：优良的免疫原性与反应原性是生物制品菌（毒）种标准的重要指标。通常也可通过浓缩、提纯或导入佐剂等方法提高制品的免疫效果。优良的免疫原性物质能使免疫动物产生完善的免疫应答，从而获得坚强的免疫力。反应原性高，即使微量抗原物质进入机体即能产生强烈的免疫反应，在血清学上会出现很高的特异性。4．毒力应在规定范围以内：用于制造弱毒疫苗的菌（毒）种，在保持良好免疫原性前提下，其毒力尽可能弱些；用于制造抗血清、灭活疫苗和疫苗效力检测的菌毒种应为强毒力菌（毒）种，而且抗原性要尽量高。强毒力细菌的毒性物质一般为细菌毒素，在未处理前的毒力极强，对动物不安全，所以必需对其致病力进行测定。如果用于制造灭活疫苗，在生产过程中必须注意彻底灭活，并加强疫苗的安全性检验。二、强菌（毒）种选育强菌（毒）种广泛用于诊断制品、抗病血清、灭活疫苗和疫苗制品的效力检验；用作人工培育弱毒株的原始毒种；及用于微生物学、免疫学及动物传染学等研究。强菌（毒）种常自疾病流行地区的典型患病动物体内分离。在疾病流行初中期，以临床状和病理变化典型而又未经任何治疗的患病动物可分离到毒力强和抗原性良好的自然菌毒株，如我国的石门系猪瘟病毒和多杀性巴氏杆菌C44-1等。然后，用从各地分离的自然强菌（毒）株中筛选出符合标准的菌（毒）株，供生物制品制造与检验。菌（毒）种的筛选内容1．毒力测定：常用易感实验动物、本动物、鸡胚或易感细胞测定分离菌（毒）株MLD（最小致死量）、LD50（半数致死量）、CELD50（鸡胚半数致死量）、CEID50（鸡胚半数感染量）或TCID50（细胞半数感染量）。2．抗原性测定：菌（毒）株的抗原性包含刺激机体产生抗体及致敏淋巴细胞的免疫原性和抗原与抗体结合发生特异性反应的反应原性。免疫原性，多采用对免疫动物用定量原强菌（毒）株菌（毒）液攻击测定，以保护率表示。无论致病力测定或抗原性测定，均应设阴阳性对照，否则无效。反应原性，多采用血清学方法测定，以抗体滴度或效价表示；3．稳定性测定：对适应于培养基、鸡胚或易感细胞上增殖培养和传代的菌（毒）株的毒力（致病力）和抗原性还要进行稳定性测定，以证明其后代特性不变，才有使用价值，并参与筛选择优。4．综合判定，冻干保存：根据致病力、抗原性和稳定性测定结果，筛选出毒力强、抗原性好、性状稳定的菌（毒）株，经增殖后进行冻干保存。冻干后的菌种于4℃保存，冻干的病毒种保存于-20℃以下，可保存多年。通常经鉴定的菌（毒）种批，按需分装后冻干保存，可使用多年。冻干菌（毒）种一经动物传代，即应重新分离、鉴定和检测后方能供种子或种毒用。三、弱毒菌（毒）种选育从自然界筛选，或以人工改变野生型强毒株的遗传特性进行培育获得。无论自然弱毒株或人工培育弱毒株，均由于DNA上核苷酸碱基的改变，而导致遗传性状突变及毒力降低的结果。弱菌（毒）株的重要特征是致病力极微弱或无致病力，免疫原性优良，能使免疫动物获得坚强的免疫力。弱毒菌（毒）种主要用于弱毒活疫苗、部分诊断制品和抗血清的制造。弱菌（毒）种的选育途径和常用方法。（一）自然弱毒株的选育又称自发突变毒株，在自然因素作用下，由自然强毒株因遗传基因突变形成了与祖代性状（特别是致病力和抗原性）不尽相同的生物株。因此，人们往往有意或无意地从自然中分离、筛选和育成一些弱毒菌（毒）株，作为兽医生物制品的种毒。这些自然因素，如异种非易感动物、温度、日光、干燥、紫外线等都可能是导致细菌和病毒自发突变的原因。例如鸡新城疫LaSota弱毒株和D10弱毒株是从自然鸡群和鸭群中分离到的，然后再通过克隆、挑选等途径育成。鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒FC126株即分离于火鸡，对鸡无致病性，其抗原性与鸡马立克氏病病毒一致。微生物自发突变率往往很低，形成具有稳定遗传性状的过程比较长，因此获得的机率不高。（二）经典方法诱发突变弱毒株的选育某些化学药物可引起微生物DNA核苷酸碱基发生改变，从而使该微生物遗传性发生变化，这类物质为诱变剂。某些物理因素也能引起微生物突变，使其代谢类型发生变化，从而获得遗传性状不同于祖代的毒株。某些异种非易感动物，能使强迫进入的微生物经传代诱变、适应而发生遗传性状不同于祖代突变，也能育成弱毒株。此外，也可通过细胞或禽胚等传代发生突变而育成弱毒株。这些途径既可单独使用，也可交叉联合使用。1．通过化学途径选育化学诱变剂在工业微生物突变株应用极广，在兽医微生物中成功的较少。微生物在体外培养传代过程中，经诱变剂处理，可极大地提高其基因突变率，从而获得弱毒菌（毒）株。亚硝基胍是一种烷化剂，具有强大的诱变作用，微量即引起微生物突变，诱变率达1%，主要干扰DNA的复制。例如，通过亚硝酸基胍处理支原体育成了鸡支原体疫苗株和肺炎支原体突变株；猪副伤寒沙门氏菌强毒株则在含有1/500~1/1000醋酸铊的肉汤培养基中培养传代50代次，可培育成弱毒株，用于制造疫苗。2．通过物理途径选育热和干燥等物理因素可干扰DNA的复制，从而引起突变，导致遗传性状的改变。如，巴斯德在1881年即将炭疽强毒菌株在42.5℃高温下长期传代培养，导致菌的遗传性状变异，从而育成了炭疽弱毒菌株作为制造用菌种。1885年巴斯德又将含有狂犬病病毒的脑脊髓置于干燥条件中处理，制成弱毒疫苗。日本乙型脑炎病毒强毒株则经紫外线照射后引起突变，从而出现遗传性状分离，再进行蚀斑挑选，育成了弱毒株，用于制造疫苗。3．通过生物途径选育通过生物途径育成的弱毒株，其生物稳定性极佳，但育成过程比较长。迄今，大部分活疫苗的菌（毒）种由该途径选育成功的。常用的育成路线有：（1）适应非易感动物（非自然宿主）：通常用兔、小鼠、地鼠、豚鼠、鸡和鹌鹑等实验动物进行。其优点是动物来源广、饲养管理方便、成本低及操作简便。多采取大剂量腹腔、静脉或脑内接种。如我国的猪瘟兔化弱毒株，是将猪瘟病毒强毒株通过兔体传400余代后育成的；将口蹄疫A型及O型强毒通过乳鼠皮下或肌肉接种传代，取其肌肉含毒组织再适应于鸡胚，育成口蹄疫弱毒株；鸭瘟鸡胚化弱毒株则是将强毒株通过鸭胚9代和鸡胚23代后培育即成。（2）适应细胞：通常多采用同源或异源动物组织的原代细胞，或者是一种细胞，或者用2种细胞。日本育成的猪瘟GPE弱毒株是将猪瘟ALD强毒株通过猪睾丸细胞142代和牛睾丸细胞36代后，再在豚鼠肾细胞传至41代后育成的。我国的马传染性贫血驴白细胞弱毒株，是将马传贫驴强毒株通过驴白细胞传代育成的。（3）杂交减毒：将两种遗传性状不同的菌（毒）株，在传代培育中进行自然杂交，以导致不同菌（毒）株间基因发生交换而育成有使用价值的弱毒株。如流行性感冒弱毒株的育成，是将温度敏感弱毒株（抗原性较低）与流行强毒株进行混合培养传代，使两者毒力基因发生交换，其后代即成为毒力低和抗原性强的毒株，再用于制造弱毒疫苗。选择由于微生物变异的方向难以预测，所以只能在培育过程中对各个表现遗传性状的群体按照需要进行选择，以求筛选出目的变异株。首先从外表观察和检查开始，然后再作系统的检测筛选。初选依据包括：①细菌菌落特征的变异，如菌落大小、形状、色泽、粗糙或光滑和荧光等；②病毒蚀斑的变异；③对温度敏感性变异；④对药物敏感性变异；⑤对营养要求变异，如对氨基酸的特殊需要；⑥对宿主动物易感性变异。我国一些弱毒株的育成线路与方法弱毒株致弱线路与方法猪丹毒弱毒菌株（GC42）强毒株→豚鼠370代→鸡42代猪丹毒弱毒菌株（G4T10）强毒株→豚鼠370代→含有0.01%~0.04%吖啶黄血液琼脂培养基上传10代猪肺疫弱毒菌株（EO630）强毒株→含海鸥牌洗衣粉培养基上传630代马流产弱毒菌株（C355）强毒株→含醋酸铊培养基传代我国一些弱毒株的育成线路与方法弱毒株致弱线路与方法羊链球菌弱毒菌株（F60）强毒株→鸡10代→培养基42-44℃传10代→鸽10代→培养基42-44℃10代→鸡10代→培养基42-44℃10代→鸽10代禽霍乱弱毒菌株（G190E40）强毒株→豚鼠190代→鸡胚传代布鲁氏菌羊5号弱毒菌株布氏羊型强毒株→鸡胚传代牛肺疫兔化弱毒株牛肺疫强毒株→兔传代牛瘟兔化弱毒株，猪瘟兔化弱毒株强毒株→兔传代羊痘弱毒株、鸭瘟弱毒株强毒株→鸡胚传代马传贫驴白细胞弱毒株马传贫驴强毒株→驴白细胞传代鸡痘弱毒株强毒株→鹌鹑传代口蹄疫A型鼠化弱毒株、O型鼠化弱毒株、ZB型弱毒株牛源强毒株→乳鼠传代第二节细菌培养技术一、细菌繁殖规律与生长条件（一）细菌繁殖规律（二）细菌的营养1．水水是细菌所需营养物质的良好的溶媒，也是细菌本身的重要组成成分（细菌含水73.3％～98.3％）。细菌的营养渗透、吸收及代谢产物的分泌和排泄作用等也均须以水为媒介。2．碳碳是所有细菌必需的，用以合成细菌的原浆成分。自养菌可自CO2得到碳源；异养菌除从有机物得到碳源外，也需要少量CO2。葡萄糖是组成细菌细胞多糖的基础，于培养液中加入一定量葡萄糖能促进多种细菌的代谢，增加菌数。戊糖是核酸组成成分。已糖和戊糖则是细菌细胞生长繁殖的能量来源。细菌一般不能利用有机酸作为碳源，但一些分解糖类能力低的细菌（如梭状芽孢杆菌）则以氨基酸作为碳和氮的能量来源。3．氮细菌含氮约占干重的10％。各种细菌利用氮源合成的能力有所不同。如：大肠杆菌可利用无机氮(硫酸铵)合成天门冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、氨基丁酸、缬氨酸和异亮氨酸；某些布鲁氏菌菌株则需要谷氨酸、丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、蛋氨酸和胱氨酸；葡萄球菌生长需甘氨酸、缬氨酸和L脯氨酸等必需氨基酸；梭状芽孢杆菌生长必须要有亮氨酸、酪氨酸、精氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，而蛋氨酸、组氨酸和胱氨酸对其生长有促进作用。4．盐类培养基中加入钠、钾、铁、硫酸盐、磷酸盐和氯化物等对细菌生长繁殖非常有利。它们一方面是构成细菌细胞的成分，调节渗透压；另一方面，参与细菌生理代谢，维持细菌活性。如：镁既可与细菌细胞核糖核酸结合，又与磷酸化酶作用密切相关；铁则是细菌细胞过氧化酶、细胞色素和细胞色素酶的组成成分。5．生长因子是指一类细菌本身不能合成而在代谢过程中需要的和能促进细菌生长的一类有机物质，如维生素、氨基酸、嘌呤、嘧呤、脂肪酸和血液中的X因子等。它们多存在于血液、肝浸液、腹水及马铃薯汁和酵母浸出液。血液中的X因子对细菌呼吸起着重要作用。维生素B12是细菌物质代谢过程中的重要因子。维生素C在代谢中具有传递氢的功能。（三）细菌生长的环境条件1．气体与细菌生长繁殖有关的气体主要是CO2和氧气。根据细菌对氧气的需要可分为四类：①需氧菌：该类细菌在有氧的环境中才能生长繁殖，如炭疽杆菌、结核分枝杆菌等，能利用空气中的氧。②微需氧菌：如猪丹毒杆菌、牛型布