3-5-二硝基水杨酸比色法测还原糖含量

3，5-二硝基水杨酸比色法测量还原糖含量一．实验目的1、掌握用制作标准曲线的方法来测量还原糖的含量.2、学会使用721精密型分光光度计。3、熟练容量瓶、移液管等简单仪器的使用方法。二．原理1、还原糖是指含有醛基或者酮基的糖类，单糖都是还原糖，多糖中有乳糖和麦芽糖等是还原糖，而淀粉和蔗糖是非还原糖。DNS即3，5-二硝基水杨酸中含有的硝基使其有较强的氧化性，与醛基在加热的条件下发生氧化还原反应，生成红色物质3-氨基-5硝基水杨酸。反应方程式如下：2、不同浓度的还原糖液与DNS反应时，生成的3-氨基-5硝基水杨酸的浓度不同，导致反应后液体颜色深浅不同。在分光光度计下测量标准梯度浓度的葡萄糖溶液与DNS反应后液体的OD540（波长为540nm条件下样液的光密度值），做出OD540——还原糖含量标准曲线，对于未知样品的测量，只需将OD540带入图像，找到相应的还原糖含量值即可。3、本实验总糖的测量步骤中，因为样品（面粉）主要由淀粉构成不能与DNS直接反应，所以需要用酸水解法将淀粉降解为单糖进行测量。淀粉由单糖缩合产生，在降解过程中会引入水分子，所以计算总糖的质量时，应除去水的质量。M葡萄糖=180，M水=18，由于淀粉的碳链极长，忽略链末端本身含有的一个水分子，则淀粉的质量为还原糖质量的180−18180=0.9倍。三．试剂（配制方法）提前配制试剂DNS（3,5-二硝基水杨酸试剂）：6.3g3,5-二硝基水杨酸和262ml2mol/LNaOH加到热酒石酸钾钠的热溶液中（182g酒石酸钾钠溶液溶于500蒸馏水中），再加5g重结晶酚和5g亚硫酸氢钠于其中，搅拌溶解，冷却后定容到1000ml，储存于棕色瓶中。碘化钾—碘试剂：称取5g碘10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。酚酞试剂：0.1g酚酞溶于250ml85%的乙醇中，棕色瓶储存。6mol/LHCl溶液6mol/LNaOH溶液面粉样品0.5mg/mL葡萄糖溶液：精确称取105℃烘至恒重的葡萄糖1g，用水定容到1000ml。四.实验仪器（一）每组配置试管：10ml*10试管架：1试管夹：2铁架台：1移液管：1ml*25ml*210ml*1移液管架：1胶头滴管：2培养皿：1容量瓶：100ml*3漏斗:1烧杯:100ml*3500ml*1（二）公用仪器分光光度计：3比色皿：3*4水浴锅：6蒸馏水：瓶*3滤纸：若干称量纸：若干废液缸：1L烧杯*3五．操作步骤（一）标准梯度糖液配制分别取0.5mg/ml的葡萄糖标准液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml于1~6号试管中，并用蒸馏水补足到1ml。（二）还原糖液的提取1、精确称取面粉1.0g于100ml小烧杯中，少量水调成糊状后，再加入50ml蒸馏水搅匀。2、水浴50℃保温20min后，用水定容到100ml。3、过滤，取滤液1ml于7、8号试管中，待用。（三）总糖的水解与提取1、称取面粉1.0g，放入100ml小烧杯中。2、加入10ml6mol/L的HCl，和15ml蒸馏水，沸水浴加热25min.3、用胶头滴管滴2~3滴碘化钾—碘溶液于培养皿中（可以稍微稀释），用细玻璃棒蘸少量样品与之进行反应，若无深蓝色物质产生说明总糖已经水解完全，否则继续沸水浴加热并每隔5min以相同的方法再次测定，直至完全水解。4、取出完全水解的样品，冷却后滴加2~3滴酚酞，用6mol/LNaOH滴定至中性。5、用水定容到100ml，过滤，取5ml滤液，再次定容到100ml。6、取5中第二次定容的液体1ml于9、10号试管中，待用。（四）OD540的测量及标准曲线的制作1、在10支试管中加入0.5mlDNS试剂，混匀，十只试管放入500ml装有少量水的烧杯中，进行沸水浴加热5min，再流水冷却。2、每支试管加入再4.0ml蒸馏水并摇匀。3、取液体装入比色皿中，每个样品测三次，取其平均值为其OD540，以未加葡萄糖的试管即1号试管内的液体作为参比液。4、取1~6号试管中的数据，做出OD540~还原糖含量曲线，纵坐标为OD540，横坐标为0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，单位mg。5、在曲线上读出7~10号试管的含量值。（五）计算含量1、取7，8号试管含量的平均值作为还原糖含量值，取9，10号试管含量的平均值作为总糖的含量值。2、还原糖含量%=还原糖毫克数×样品稀释倍数（100）样品毫克数（1000）×100%总糖含量%=水解后还原糖毫克数×样品稀释倍数（2000）×0.9样品毫克数（1000）×100%六．实验注意1、标准曲线的制作建议用EXCEl制作，也可以只用坐标纸，用最小二乘法得出公式，需附图在实验报告上。2、本实验中用水浴锅进行操作，沸水浴操作时，只需将温度控制在90~93℃即可，温度过高（超过95℃）会使还原糖煮糊。3、OD540在测量时，每一个比色皿都需要测量三次（包括标准糖液、还原糖液和总糖液），取平均值。测量时，打开盖子再重新盖上盖子读出OD540即为一次测量，同一个比色皿再测量时不要拉动伸缩杆。4、标准曲线制作过程中如有明显偏离直线的一个点，应果断舍去，如果有两个或者两个以上的时候，全部10支试管的糖液重新制作。这是为了使所有的糖液在相同的条件下加热，避免无关因素引起的误差。5、10%NaOH滴定时，滴定终点应为滴加半滴NaOH溶液刚刚变为粉红色，且静置30s不褪色。若多滴则重新加入盐酸进行滴定，若少滴，则用半滴法进行滴定。附实验数据记录试管编号12345678910糖液/mL00.20.40.60.811111蒸馏水/mL00.80.60.40.200000OD540第一次第二次第三次平均值含量值/mg00.10.20.30.40.5