08.药品微生物限度检测技术

1第八章药品微生物限度检测技术中药和生物系2第一节药品微生物限度检测概述中药和生物系3药品微生物限度检查定义非规定灭菌制剂及其原辅料：微生物的种类和数量必须限制在一定的范围内或不得检出。4部分口服给药制剂:口服液、酊剂、中药丸剂、糖浆剂、散剂、特殊部位使用的片剂（口腔帖片、阴道片、阴道泡腾片、外用可溶片）含中药原粉、豆豉、神曲、动物组织等口服制剂鼻用制剂洗剂灌肠剂等非规定灭菌制剂及其原、辅料药品微生物限度检查适用剂型5一、药品微生物限度检查意义确定药物是否污染或其污染程度，控制药品的质量；保证用药的有效性和安全性；可作为衡量药品生产全过程卫生水平的根据之一。6二、药品微生物限度检测的内容内容无菌检查微生物限度检查微生物总数检查控制菌检查①细菌数检查②霉菌和酵母菌检查①大肠埃希菌②大肠菌群③沙门菌④铜绿假单胞菌⑤金黄色葡萄球菌⑥梭菌⑦白色念珠菌非全检，检查种类与剂型、给药途径、原料来源等有关。7给药途径口服给药制剂细菌数每1g不得过1000个。每1ml不得过1000个。霉菌和酵母数（每1g、1ml或10cm2）不得过100个大肠埃希菌（每1g、1ml或10cm2）不得检出金黄色葡萄球菌—铜绿假单胞菌—沙门菌（每10g或10ml）含动物组织（包括提取物）的口服制剂，不得检出霉变、长螨不合格8给药途径眼部给药制剂细菌数每1g或1ml不得过10个霉菌和酵母数（每1g、1ml或10cm2）不得检出大肠埃希菌（每1g、1ml或10cm2）不得检出金黄色葡萄球菌（每1g、1ml或10cm2）不得检出铜绿假单胞菌（每1g、1ml或10cm2）不得检出沙门菌－霉变、长螨不合格9给药途径直肠给药制剂细菌数每1g不得过1000个，每1ml不得过100个。霉菌和酵母数（每1g、1ml或10cm2）不得过100个大肠埃希菌（每1g、1ml或10cm2）不得检出金黄色葡萄球菌（每1g、1ml或10cm2）不得检出铜绿假单胞菌（每1g、1ml或10cm2）不得检出沙门菌－霉变、长螨不合格10第二节药品微生物限度检测条件中药和生物系11一、药品微生物限度检测的特殊性活体性和不稳定性分布的不均匀性多数处于受损伤状态生态环境的多样性及复杂性12二、药品微生物限度检测的基本条件检查环境和人员要求㈠环境要求:无菌室内进行。背景洁净度10,000级下的局部100级，单向流空气。操作人员：卫生、着装符合要求。操作要求：严格遵守无菌操作，严防污染。13二、药品微生物限度检测的基本条件方法验证㈡由于某些供试品具有抗菌活性，在建立测定方法或原测定法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。14二、药品微生物限度检测的基本条件正确抽样㈢1.抽样方法①随机②优先抽有疑问样品③抽样量：检测用量的3~5倍15二、药品微生物限度检测的基本条件正确抽样㈢2.检测用量①＞2个最小包装②大蜜丸≥4丸③膜剂≥4片3.检测量①半/固体制剂：10g②液体制剂：10ml③膜剂：100cm16二、药品微生物限度检测的基本条件检查菌培养基培养温度培养时间细菌数营养琼脂30℃～35℃3days真菌数玫瑰红钠琼脂23℃～28℃5days酵母菌数酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂23℃～28℃5days控制菌细菌：30℃～35℃真菌：23℃～28℃培养条件㈣17二、药品微生物限度检测的基本条件供试品检出控制菌或其它致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下的规定，应从同一批样品中随机抽样，独立复试两次，以3次结果的平均值报告菌数。供试品的细菌数、霉菌和酵母数及控制菌三项检验结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。结果判断㈤18第三节药品微生物限度检测方法中药和生物系19一、细菌数、霉菌和酵母菌数检查1.平皿法数据处理混合平板的制备细菌、真菌的培养检查结果、观察与计数供试液的制备书写检验记录单20一、细菌数、霉菌和酵母菌数检查1.平皿法倒置培养3d营养琼脂培养基30~35℃玫瑰红钠琼脂培养基倒置培养5d23~28℃对照对照对照对照1.0ml9.0ml稀释液10g/ml供试品9.0ml10-210-11.0ml9.0ml10-31.0ml10倍递增稀释法21Viablecellcount1.dilutesample1ml9ml1010010001041051061072.plateout0.1ml22一、细菌数、霉菌和酵母菌数检查10g或10ml供试品10－1供试液取相当于1g或1ml供试液用滤膜过滤、冲洗取下滤膜，菌面朝上放培养基上培养结果观察与计数数据处理书写检验记录单2.薄膜过滤法23242526272829一、细菌数、霉菌和酵母菌数检查－（薄膜过滤法）阴性对照：取供试品微生物限度检查相应的溶剂和稀释液同法操作，阴性对照不得长菌30一、细菌数、霉菌和酵母菌数检查－薄膜过滤法结果判断细菌总数真菌总数符合药典该品种项下限度规定判定药物的细菌、真菌总数检验合格否则因从同一批次产品中重新抽样，独立复试三次，以三次结果的品均值报告菌数31一、细菌数、霉菌和酵母菌数检查3.操作注意事项1.尽量使菌细胞分散开，使每个菌细胞生成一个菌落，否则将会导致重大的技术误差。2.为防止细菌增殖及产生菌苔，制成供试液后，应尽快稀释，注皿。一般稀释后应在1小时内操作完毕。32一、细菌数、霉菌和酵母菌数检查3.操作注意事项3.使用吸量管时，应小心沿管壁加入，不用触及管内溶液，以防吸管尖端外侧黏附的溶液混入其中。4.注意抑菌现象。由于防腐剂未被中和，往往使平板计数结果受影响，如低稀释时菌落少。而高释释度时菌落数反而增大。遇此情况应重复检验，以确定是防腐剂影响还是操作技术误差。33一、细菌数、霉菌和酵母菌数检查3.操作注意事项5.为检查和控制灭菌效果，应做空白对照，以检验所使用的物品是否彻底灭菌及检验过程是否无菌操作。6.为便于区别药品中的颗粒与菌落，可在每100mL营养琼脂中加入1mL0.5％的TTC溶液，如有细菌存在，培养后菌落呈红色，而药品的颗粒颜色无变化。34一、细菌数、霉菌和酵母菌数检查4.菌落计数及报告方法宜选取细菌、酵母菌平均菌落数小于300cfu、霉菌平均菌落数小于100cfu的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。（1）当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数报告菌数;当有2个或2个以上稀释级的菌落数符合上述规定，以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告之。（2）如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。35例次各稀释级（供试液1ml/皿）平均菌落数（cfu）报告方式(CFU/g,ml，10cm2）原液10-110-210-31－64826402－42064864003－不可计42064640004－00.50＜1005－－00＜1006－000＜107000－＜1一、细菌数、霉菌和酵母菌数检查4.菌落计数及报告方法细菌总数＝平均菌落数×稀释倍数2020/1/213637二、控制菌检查－检查项目（1）阴性对照试验：取稀释液10ml按相应供试品控制菌检查法检查，应无菌生长。（2）阳性对照试验：供试品+10~100CFU阳性对照菌，应检出相应的阳性对照菌。（3）供试品控制菌检查：依相应的检查方法进行。38二、控制菌检查－检查流程供试品增菌培养分离培养纯培养染色镜检生化反应试验报告结果39二、控制菌检查－检查流程1.增菌培养目的使被检药物中的被检菌增殖，避免出现漏检。40二、控制菌检查－检查流程2.分离培养目的经增殖培养后,被检菌大量繁殖，同时其他一些杂菌也出现增殖。因此分离培养能使目的菌从混合菌中分离出来。41二、控制菌检查－检查流程3.纯培养目的只是大量增殖被检菌，用于后面的进一步检验。42二、控制菌检查－检查流程4.染色镜检目的初步鉴定，观察细菌的形态大小。43二、控制菌检查－检查流程5.生化试验目的最终的鉴定依据，结合染色镜检得出实验结果，填写检验报告。44二、控制菌检查－大肠埃希菌检查★大肠埃希菌俗称大肠杆菌，属肠杆菌科埃希菌属，革兰阴性杆菌，兼性厌氧菌，能发酵多种糖产酸产气。45二、控制菌检查－大肠埃希菌检查★大肠埃希菌检查意义大肠埃希菌为条件致病菌，当人体免疫力低下或是侵入肠外组织、器官，可引起肠外感染，乃至败血症。也可随人和动物的粪便排出体外，污染环境，一旦食品、药品、水等物品中检出该菌，说明已受粪便污染，可能存在其他肠道致病菌和寄生虫卵，人们饮用或服用它们则可能引起消化道传染病。46二、控制菌检查－大肠埃希菌检查书写检验记录单双阳或双阴性增菌培养供试液的制备检查结果判断配培养基和稀释液靛基质试验荧光检查一阴一阳分离纯化最终结果判断★大肠埃希菌检查流程图胆盐乳糖M蓝白萤光玫瑰红色液面EMB琼脂/麦康凯琼脂平板菌落特征→革兰染色、镜检→生化试验:乳糖发酵试验、IMViC试验2020/1/2147乳糖胆盐培养基EMB琼脂培养基靛基质试验气泡，培养基呈黄色紫黑色金属光泽玫瑰红色液面2020/1/2148大肠埃希菌产气杆菌IMViC试验大肠埃希菌+(或-）+--产气杆菌--++49二、控制菌检查－大肠埃希菌检查★大肠埃希菌检查结果报告检出大肠埃希菌MUG阳性，靛基质阳性MUG阳性，靛基质阴性，IMViC为－＋－－，G-MUG阴性，靛基质阳性，IMViC为＋＋－－，G-50二、控制菌检查－大肠菌群检查★大肠菌群大肠菌群是指37℃生长时能发酵乳糖，在24h内产酸产气的革兰阴性无芽胞需氧及兼性厌氧杆菌。51二、控制菌检查－大肠菌群检查★大肠菌群检查意义大肠菌群主要存在于温血动物粪便中，随粪便排出体外后可直接污染药品，若产品中检出该菌群，表明该产品受到粪便污染，可能存在肠道致病菌并引起疾病，以此作为粪便指示菌比大肠埃希菌更具广泛卫生学意义，是评价化妆品卫生质量的重要指标之一。52二、控制菌检查－大肠菌群检查产酸：黄色产气：气泡产酸产气书写检验记录单不产酸不产气增菌培养供试液的制备配培养基和稀释液检查结果判断30-35℃18-24h分离培养乳糖发酵验证试验最终结果判断30-35℃24-48h特征菌落36±1℃18~24h胆盐乳糖M产酸：黄色产气：气泡紫黑色/桃红色★大肠菌群检查流程图EMB琼脂/麦康凯琼脂平板53二、控制菌检查－大肠菌群检查★大肠菌群检查结果报告－大肠菌群MPN表根据发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。各供试品量的检出结果最可能的大肠菌群数N（个/g或ml）1.0g或1.0ml0.1g或0.1ml0.01g或0.01ml+++＞102++-10＜N＜102+--1＜N＜10---＜154二、控制菌检查－沙门菌检查★沙门菌沙门菌是指一群寄生于人类和动物肠道内的革兰阴性兼性厌氧杆菌，不发酵乳糖和蔗糖，发酵葡萄糖和甘露醇。55二、控制菌检查－沙门菌检查★沙门菌检查意义沙门菌是肠杆菌科的重要致病菌，可随粪便或带菌者接触污染药品原辅料、制药用水、设备、半成品、成品，尤其是动物脏器为原料的药物，服用后有引起人类伤寒、副伤寒、急性肠炎即败血症等疾病的危险。2020/1/2156二、控制菌检查－沙门菌检查★伤寒菌检查流程图靛基质试验脲酶试验生化试验氰化钾试验赖氨酸脱羧酶试验动力试验血清学凝聚试验有特征菌落三糖铁琼脂培养基穿刺接种最终结果判断增菌培养供试液的制备书写检验记录单分离纯化无菌落或无特征菌落配培养基和稀释液预增菌营养肉汤四硫磺酸钠亮绿培养基①SS琼脂②麦康凯琼脂①黑色②半透明初步鉴别2020/1/2157四硫磺酸钠亮绿培养基空白对照SS培养基黑色菌落麦康凯培养基半透明菌落2020/1/2158三糖铁斜面疑似菌落赖氨酸脱羧酶培养基紫色半固体营养琼脂培养基血清凝集59二、控制菌检查－沙门菌检查★沙门菌检查结果报告检出沙门菌革兰阴性