质粒

第六章质粒质粒：是指存在于细菌、真菌等微生物细胞中、独立于染色体外、能进行自我复制的遗传因子。a、可以整合到染色体上，又可以游离于染色体外（附加体）b、质粒通常是共价、闭合、环状双链DNA(covalentclosedcircularDNA，简称cccDNA)，c、分子大小范围从lkb左右到1000kb。第一节质粒的发现和命名大肠杆菌的F因子是第一个被发现(1946年)的细菌质粒，它的发现对细菌遗传学的发展产生了深远的影响。日本学者(1957年)报道了志贺菌(Shigella)中质粒介导抗生素抗性的转移现象。在以后的20多年中，陆续发现各种细菌携带质粒，且它们的表型特征已远远超过了致育性和药物抗性的范围。一、质粒的发现二、质粒的命名原则1976年Novick等提出一个可为质粒研究者普遍接受和遵循的命名原则：1.质粒的名称一般由几个英文字母及编号组成，第一个字母一律用小写p表示，后两个字母应大写，可以采用发现者人名、实验室名称、表型性状或其他特征的英文缩写。2.编号为阿拉伯数字，用于区分属于同一类型的不同质粒，如pUC18和pUC19,pBR322等。第二节质粒编码的遗传表型大多数的质粒均控制着宿主细胞的一种或几种特殊性，即具有一定的表型，质粒可依其表型的不同主要划分为以下几种类型:1.致育质粒2.抗药性质粒3.产生毒素的质粒4.降解质粒5.致病性质粒6.共生固氮质粒致育质粒这类质粒(R质粒)能使宿主微生物对抗生素、化学药物或重金属离子等杀菌剂表现出抗性。R质粒R100产生抗生素或细菌素的质粒产生毒素的质粒降解质粒乙醛丙酮酸盐水扬酸盐萘致病性质粒Opines:冠樱碱Octopine（章鱼碱）Nopaline（胭脂碱）共生固氮质粒隐蔽质粒1.理化因子消除法质粒消除有两种作用机制：a.对质粒本身的复制和分离产生抑制作用，从而在细菌生长繁殖过程中逐步淘汰b.选择性抑制带有质粒的菌的生长2.原生质体诱导的质粒消除第三节质粒的检测一、质粒的消除第三节质粒的检测二、遗传转移三、分子杂交四、质粒的分离、检测与纯化1.琼脂糖凝胶电泳2.氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心3.电镜观察一、质粒的大小和拷贝数1.质粒大小的测定与标准质粒电泳比较，酶切分析，电镜照片推算，序列分析。2.质粒的拷贝数：指每个细胞中存在的质粒的数量。质粒的拷贝数与其分子质量成反比关系，分子质量大的拷贝数低，分子质量小的拷贝数高。第四节质粒的复制和调节质粒可根据其拷贝数分为严谨型质粒（Stringentplasmid）和松弛型质粒（Relaxedplasmid）。质粒在细胞内复制时受到控制而与染色体复制同步进行，被称为严紧型质粒。其拷贝数也低，通常只有1-3个拷贝。如F质粒。另一类质粒的复制与染色体复制不同步，称为松驰型质粒。通常每个细胞含有10-100个拷贝，属于高拷贝质粒。如分子量小的ColEl质粒。二、质粒的复制细菌染色体是一个复制子，每一个质粒也是一个复制子。质粒的复制起点称为oriV。质粒复制子拷贝数pBR322及其衍生质粒pMB115-20pUC系列质粒pMB1500-700pACYC及其衍生质粒p15A10-12pSC101及其衍生质粒pSC101∽5ColE1ColE115-20几种常见质粒载体所携带的复制子质粒的复制主要是通过θ型复制和滚环复制两种方式之一进行的，其中以θ型复制为主。在θ型复制中，有单向复制和双向复制两种类型。革兰氏阴性细菌中多数质粒是以θ型方式复制，R1、R100等是单向复制，F、R6k等是双向复制类型。1.质粒复制的方式在革兰氏阳性细菌中大多数质粒是以滚环方式复制。复制起点是一段特定的DNA序列，长约几百碱基对，在其相关的调控元件中含有由质粒或宿主染色体编码的、参与DNA合成起始调控因子的结合位点。ori区域常决定了质粒的许多特性，如质粒的寄主范围和质粒的拷贝数。2.复制起点(ori)区的功能三、质粒复制的调控质粒的复制过程与细菌染色体的复制基本相同，但质粒的复制调控与染色体的复制调控有明显区别。目前发现的质粒复制调控一般采用直接或间接的负调控机制，负调控因子可以使蛋白质、RNA或DNA重复序列。质粒复制调控大致可分为两种类型：1.抑制物-靶位调控2.重复子-竞争结合调控抑制物-靶位调控重复子-竞争结合调控四、不相容性和质粒的类群质粒不相容性：是指亲缘关系相近的两种质粒，在非选择性条件下常不能稳定地存在于同一个细胞中，经过若干代的培养，只含有同一种质粒的细胞越来越多，而含有两种质粒的细胞相对减少。这种现象称为质粒的不相容性（incompatibility）。一般来说，同一类型的质粒是不相容的，而不同类型的质粒则是相容性的。细菌种类质粒不相容群代表性质粒革兰氏阴性细菌IncFⅠF,R386,R455,ColVIncFⅡR1,R100IncFⅢCol1B-K98IncFⅣR124IncARA1IncCR40a,R55IncHR27,R726IncIColIb-P9,R144,R483,R64,R621aIncMR69,R466bIncNR46,R15,N3,pKM101IncOR16,R723IncPRP1,RP4,R68,R751,R690,RK2IncQRSF1010,pKT212,pKT230,pGSSIncWR7K,R388,pSA747IncXR6K革兰氏阳性细菌pT181pT181,pC221,pS194,pC223,pUB112,pE194pUB110pBC110,pBC16pSN2pSN2,pE12,pIM131.每个世代每个质粒平均都必须至少发生一次复制；2.当细胞分裂时，复制产生的质粒拷贝必须平均分配到两个子细胞中去。五、质粒的稳定性(细胞分裂中的质粒分配)要使质粒能够保持稳定的遗传，至少需要满足下面两个方面的条件：在细胞分裂过程中，质粒分配到子细胞的途径可分为：随机分配(randomdistribution)主动分配(activedistribution)低拷贝质粒的稳定性是通过质粒编码的基因产物来实现的，如质粒编码的致死蛋白来抑制不含质粒的子细胞。另外，质粒结构中还存在编码主动分配体系的par区。par区叫做分配区(partitionregion)或分配座位(partitionlocus)：是指在细胞分裂过程中使质粒拷贝数均等的分配到子细胞中的质粒DNA序列。质粒的复制与分配是分开独立进行的，而且par区还会使无亲缘关系的其他质粒保持稳定。1.主动分配的机理GGTCTGATTATTAGTCTGGGACCACGGTCCCACTCGTATCGTCCCAGACTAATAATCAGACCCTGGTGCCAGGGTGAGCATAGCAG-35-10SDsopAsopBsopCSopASopBsopA和sopB反式作用基因sopC:顺式作用位点12个43bp的正向重复序列有一对7bp的反向重复序列复制质粒分配细胞分裂质粒分配复合体复制体细菌质粒DNA的分配模型图F质粒的寄主致死体系主要由其基因组中控制寄主致死功能的基因ccdA和ccdB负责。在含质粒的细胞中，CcdA蛋白作为解毒剂专门与毒剂CcdB蛋白结合，并使之失效。在新产生的无质粒的子细胞中，开始的时候是含有CcdA和CcdB这两种蛋白质的。但由于毒剂CcdB和解毒剂CcdA具有不同的稳定性，CcdA蛋白质不稳定，易被蛋白水解酶(protease)降解，而较稳定的CcdB蛋白质便可行使其对寄主细胞的致死作用。寄主致死体系随机分配：是指在细胞分裂过程中质粒拷贝数在两个子细胞之间是随机分配的。在一般情况下，通过随机分配质粒也能够得到稳定的遗传，但在分裂中也会出现无质粒的子细胞。2.随机分配机制(randomdistribution)但在某些情况下，尤其是在recA+的宿主细胞中，ColE1常能彼此重组而形成多聚体(multimer)，从而使单个细胞内质粒的拷贝数减少，并增加产生无质粒细胞的可能性。而ColEl质粒含有不依赖于recA的cer基因，负责多聚体的解聚作用，使之重新转变为单体质粒以保证质粒在细胞分裂时的稳定性。质粒转移性：是指质粒能自动地从一个细胞转移到另一个细胞，甚至还能带动供体细胞的染色体DNA向受体细胞转移，这类质粒常常被叫做自主转移质粒(self-transmissibleplasmid)。质粒在细菌间的转移，需要供体和受体细胞间的直接接触才能进行，即接合作用(conjugation)，这类质粒又被称接合质粒(conjugativeplasmid)。六、质粒的转移性质粒分为转移性和非转移性两大类型有些质粒虽然不能自主转移，但能被其他一些自主转移质粒所转移，这类质粒又被叫做可移动质粒(mobilizableplasmid)。质粒拷贝数转移性质粒拷贝数转移性ColE110-18不能R6k1-2能ColE210-18不能RP44-7能ColE310-18不能pBR322约20不能F因子1-2能pBR325约20不能R1001-2能几种不同质粒的转移性能已知大肠杆菌的F质粒、R1、R100、ColV、Collb-P9、R6k、RP4等均属于自主转移质粒，它们是低拷贝的大质粒，其中较小的R6k质粒也有38kb。1.自主转移质粒的特点许多G-细菌中的自主转移质粒需要大于30kb的DNA来编码与接合转移有关的蛋白质，如F质粒的转移操纵子(tra)就包含23个基因，大小为33kb。tra基因和oriT在质粒自主转移过程中起着重要作用，所以大多数自主转移质粒都有tra基因和oriT位点。tra产物oriTF-oriT+F+tra+oriT+F+tra-F+tra+oriT-不能转移性菌毛转移不能转移不能转移F质粒2.可转移质粒的特点G+细菌如链霉菌中的自主转移质粒，除SCPl是巨大质粒外，很多都是10kb左右的小质粒，而与转移有关的区域只有2kb左右。自主转移质粒的大小差异可能是因为它们的转移机制不同，G+细菌中质粒的转移不需要性菌毛，因此质粒的容量就较小。七、IncP组质粒的特征和接合转移广寄主范围质粒：指质粒能通过接合转作用转移到很多不同种甚至不同属的寄主内，并能稳定地存在于这些寄主细胞内。IncP、IncN、IncQ、IncW组的质粒属于广寄主范围质粒(broadhostrangeplasmid)。IncP组的质粒的寄主较广。IncP质粒自身或带动其他质粒能从大肠杆菌转移到几乎所有的G-细菌中，有研究表明IncP质粒还能接合转移到G+细菌、酵母、植物细胞中。IncP质粒虽然能通过接合作用转移到酵母、植物等这些寄主中，但质粒却不能在这些寄主中复制，属于转移寄主。IncP质粒的特征：八、以λ噬菌体DNA为基础的载体及其应用九、广寄主范围质粒载体TetpLAFR121.6kbEcoR1COSoriTTetCosmidVector(pRK290+COS)通过双亲杂交和三亲杂交方法进行转移。pLAFR1基因文库/E.coli根瘤菌7653R-1（Nod-）根瘤菌7653R-1（pLAFR1基因文库）紫云英植株幼苗根瘤分离根瘤菌分离重组质粒pRK2013/E.coli十、BAC人工染色体为什么会想到把F质粒改造成载体？自然发生的F因子能携带1/4的大肠杆菌染色体而不显张力或不稳定。1.拷贝数低:12.有助于减少DNA分子间重组3.保证文库转化子生长平衡4.减小对受体菌的毒副作用BacterialArtificialChromosomeoriS,repE介导单向复制parA,parB维持低拷贝cosN来自phage,可被的terminase特异切割LoxP,类似的cosN来自P1,其Cre蛋白特异性切割该位点十一、基于P1噬菌体构建的载体复制元件sacB：标记基因克隆位点loxP：重组位点pac：包装识别位点kan：选择基因1、试述质粒在现代生物学研究和应用中的作用和意义？2、何谓严谨型质粒、松弛型质粒？划分依据是什么？3、质粒宿主范围是由哪些因素决定的？为什么？4、简述质粒不相容性的作用机理？5、质粒稳定性遗传，至少需要满足何种条件？6、在细胞分裂过程中，质粒分配到子