质粒的提取与纯化

实验一质粒的提取(碱法)1.实验目的2.实验原理3.实验仪器、材料与试剂4.实验步骤5.实验结果及讨论实验目的了解碱法提取质粒的原理；掌握碱法提取质粒的方法。实验原理质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。结构的三大要素：•多克隆位点•选择标记（耐药性，LacZ）•独立的复制单位种类：•质粒•噬菌体•酵母人工染色体（YAC）•反转录病毒载体•表达载体等pBCSKmapT-载体•在碱性条件（pH12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。•用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。实验仪器、材料与试剂（一）仪器1.恒温摇床2.超净工作台3.高压灭菌锅4.高速台式离心机5.微量取液器（二）材料含pBCKS质粒的大肠杆菌DH5α。含重组质粒的大肠杆菌DH5α。（三）试剂1.LB液体培养基（1L）胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl10g加去离子水至800ml搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20分钟。LB固体培养基（1L）在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。2.SolutionⅠ50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.·Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)高压灭菌后，4℃保存备用。3.SolutionⅡ(现用现配制)0.2mol/LNaOH1%SDS•4.SolutionⅢ（100ml）5mol/LKAc60ml冰醋酸11.5ml水28.5ml配制成的溶液Ⅲ含3mol/L钾盐、5mol/L醋酸（pH4.8）。•5.氨苄青霉素（Amp）用无菌水配制成100mg/ml溶液，置-20℃冰箱保存备用。6.胰RNA酶将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/LTris.Cl(pH7.5)、15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。7.氯仿，乙醇，70%乙醇。实验步骤质粒的提取1.用灭菌的牙签挑取单菌落放入50mlLB液体培养基（含Amp0.1mg/ml）中，37℃振荡培养过夜。2.将菌液倒入1.5mlEppendorf管中，10,000rpm离心1min，去掉上清液，重复两次。沉淀悬于200μLSolutionI中,涡旋使充分悬浮。3.加入300μLSolutionII，混匀（注意动作轻），冰箱3℃放置5min。4.加入300μLSolutionIII,混匀（注意动作轻），冰箱3℃放置5min。5.12,000rpm，离心5min，将上清移至1个新Eppendorf管中，注意所取体积（约600μL）。6.加入等体积氯仿（约600μL），混匀（注意动作轻）。12,000rpm，4℃，离心10min，取上清液。7.上清液中加入预冷的等体积异丙醇，-20℃沉淀20~30min。8.12,000rpm离心15min。9.去上清，沉淀加入500μL70%乙醇洗涤2次（12,000rpm离心3分钟）。10.去掉上清（注意沉淀勿丢失），室温或真空干燥沉淀。11.每管中加入25μL无菌水1μLRNase，37℃溶解质粒DNA。Biospin质粒DNA小量提取试剂盒（实际用）操作过程1.将1～1.5ml过夜培养的细菌菌液加入1.5ml离心管中。2.于10，000rpm离心30秒，并弃去上清液。如有需要，可多次重复步骤1、2，以收集更多细菌菌体。但勿过量，以免影响提取质粒的质量。3.加250μlResuspensionBuffer，重悬细菌体沉淀。重悬后应该没有细菌团块。4.加250μl细胞LysisBuffer，轻柔颠倒4～6次。不要剧烈振动，以防止基因组DNA被剪切。注意不要让反应持续超过5分钟。5.加350μlNeutralizationBuffer，立即轻柔颠倒离心管4～6次。溶液应该出现絮状物，但不会出现局部沉淀。6.于13,000rpm离心10分钟。如离心机转速不够可延长离心时间，直至形成紧密的白色沉淀。7.将步骤6离心后得到的上清液转移到Spincolumn内。于6,000rpm离心1分钟，并弃去接液管内液体。8.向Spincolumn内加650μlWashBuffer，于12，000g离心30～60秒，并弃去接液管内液体。9.重复第8步一次。10.再次于12，000rpm离心1分钟，然后将Spincolumn转移到无菌的1.5ml离心管中。如不进行该步离心，则无法保证离心柱内残液被彻底清除。11.向Spincolumn内加20μlElutionBuffer、去离子水或TE溶液，并于室温静置1分钟。可根据实验的实际需要决定洗脱液用量。12.于12，000rpm离心1分钟，1.5ml离心管内溶液中含有质粒DNA。13.提取的质粒DNA可直接用于各类下游分子生物学实验，如果不立即使用，请保存于-20℃。实验结果及讨论碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方法之一，提取量较大，便于操作。如有蛋白质残留，干燥后不透明，而呈白色。