10-5+Chapter3++蛋白质化学(F)

第三章蛋白质(Protein)蛋白质(protein)是由氨基酸为单位以酰胺键(肽键)连接起来的一类含氮的生物大分子。蛋白质存在于所有的生物细胞中，是生活细胞中数量、种类最丰富的生物大分子，构成生物体最基本的结构物质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。元素组成：所有蛋白质都含有C、H、O、N四种元素，大多数蛋白质还含有少量的S，有些蛋白质还含有一些其它元素，如P、Fe、Cu、Mo、I等。各种蛋白质的含氮量都很接近，都在16%左右，因此可通过测定生物样品中的含氮量计算出样品中蛋白质的含量，1克氮就相当于6.25克蛋白质。10-5主要内容：氨基酸的化学肽蛋白质的结构与功能蛋白质的理化性质及其分离纯化第一节氨基酸化学蛋白质用H+，OH-或酶彻底水解，可以得到许多种氨基酸的混合物，氨基酸是构成蛋白质的基本单位。组成蛋白质的基本(标准)氨基酸（aminoacid，Aa）有20种。这些氨基酸中，大部分属于L--氨基酸。其中，脯氨酸属于L--亚氨基酸，而甘氨酸则属于-氨基酸。一、蛋白质的基本单位——L--氨基酸1.L--氨基酸的结构通式及分子构型H3NCHCOOR-+αH2NCHCOOHRα或结构通式(投影式)与羧基相邻的α-碳原子上都有一个氨基，因而称为α-氨基酸构型：分子中各原子或基团之间的连接方式称为分子的构型。组成蛋白质的氨基酸除Gly以外都有手性碳原子，在三维空间上就有两种不同的排列方式，它们互为镜影，这两种不同的构型分别称为D-型和L-型。L--氨基酸的分子构型(configurition)2.基本氨基酸的分类、结构及代号(1)按侧链R基的结构氨基酸的分类(2)按侧链R基的极性氨基酸的结构及代号:(non-polar,hydrophobic)色氨酸tryptophanTrp(Try)W5.89丝氨酸serineSerS5.68酪氨酸tyrosineTyrY5.66半胱氨酸cysteineCysC5.07蛋氨酸methionineMetM5.74天冬酰胺asparagineAsnN5.41谷氨酰胺glutamineGlnQ5.65苏氨酸threonineThrT5.60(polar,uncharged)(acidic)(basic)特殊氨基酸(Specialaminoacids)–Gly•无光学活性(opticallyinactive)CHH-OOC+H3N蛋白质多肽中Gly残基的存在将增加其结构区域的柔性，而Pro残基的存在则相反，将会增加其结构区域的刚性，＊具环式结构的亚氨基酸(ringstructureandiminoacid)特殊氨基酸(Specialaminoacids)–Pro蛋白质多肽中Pro残基的存在将会增加其结构区域的刚性，而Gly残基的存在则相反，将增加其结构区域的柔性＊＊•具有活性的巯基(activethiol)易氧化形成二硫键(disulfidebond),可用作还原剂(reducingreagent)特殊氨基酸(Specialaminoacids)–Cys特殊氨基酸(Specialaminoacids)–His组氨酸侧链为一个咪唑基，在酸碱催化中起重要作用＊特殊氨基酸(Specialaminoacids)–Phe,Tyr和Trp蛋白质分子中Phe,Tyr和Trp残基的存在使得蛋白质在近紫外区(220-300nm)有特征性吸收＊3.蛋白质分子中不常见(非标准)的L--氨基酸在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为非标准(non-standard)氨基酸。这些氨基酸都是由相应的基本(标准)氨基酸衍生而来的。其中重要的有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸、3,5-二碘酪氨酸和硒代半胱氨酸等。这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下：硒代半胱氨酸(Selenocysteine)NHHOCOOH4-羟基脯氨酸H2NCH2CHCH2CH2CHCOOHOHNH25-羟基赖氨酸NH2CH3NHCH2CHCH2CH2CHCOOH6-N-甲基赖氨酸HOIICH2CHCOOHNH23,5-二碘酪氨酸(4-hydroxyproline(Hpro))(5-hydroxylysine)(6-N-methyllysine)(Diiodinotyrosine)二、天然的非蛋白质氨基酸在细胞内已发现的非蛋白组成成分的氨基酸有300多种，尽管它们不是蛋白质的构成成分，但具有广泛的生物学功能。如在尿素循环中的关键代谢中间产物：L-瓜氨酸：H2N-C-NH-CH2-CH2-CH2-CH-COO－ONH3＋(Citrulline)L-鸟氨酸：H3N-CH2-CH2-CH2-CH-COO－NH3＋+(Ornithine)1.氨基酸的一般物理性质常见氨基酸均为无色结晶,其形状因构型而异(1)溶解性：各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。(2)熔点：氨基酸的熔点极高，一般在200℃以上。(3)味感：其味随不同氨基酸有所不同，有的无味、有的味甜、有的味苦，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。(4)旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，左旋者通常用（-）表示，右旋者用（+)表示。(5)光吸收：构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。三.氨基酸的主要理化性质•酪氨酸的max＝275nm，275=1.4x103;•苯丙氨酸的max＝257nm，257=2.0x102;•色氨酸的max＝280nm，280=5.6x103;2.氨基酸的主要化学性质(1)氨基酸的离解性质及等电点BrÖnsted的酸碱理论，即广义酸碱理论。HAA-+H+酸碱质子氨基酸在水中的两性离子既能像酸一样放出质子，也能像碱一样接受质子，氨基酸具有酸碱性质，是一类两性电解质。H2NCHCOORH3NCHCOOR-+-+H+Asanacid（protondonor）：Asabase（protonacceptor）：H3NCHCOOHRH3NCHCOOR-++H++不同pH时氨基酸以不同的离子化形式存在：H3NCHCOOHRH3NCHCOOR-+++H++OH-+H++OH-H2NCHCOOR-正离子两性离子负离子氨基酸所带静电荷为“零”时，溶液的pH值称为该氨基酸的等电点（isoelectricpoint），以pI表示。实验证明在等电点时，氨基酸主要以两性离子形式存在，但也有少量的而且数量相等的正、负离子形式，还有极少量的中性分子。当溶液的pH=pI时，氨基酸主要从两性离子形式存在。pHpI时，氨基酸主要以正离子形式存在。pHpI时，氨基酸主要以负离子形式存在。H3NCHCOOHRH3NCHCOOR-++H2NCHCOOR-H2NCHCOOHR(a)氨基酸的酸碱滴定曲线Henderson-Hasselbalch方程pH=pKa+lg[质子受体][质子供体]酸碱滴定曲线等电点的计算(b)等电点的计算中性氨基酸：以Gly为例[H+]2=K1K2pH=（pK1+pK2）/2pI=（pK1+pK2）/2pI=（2.34+9.60）/2=5.97GlyK1=[Gly±][H+][Gly+]K2=[Gly-][H+][Gly±]pI时，[Gly+]=[Gly-][Gly±][H+]K1=[Gly±]K2[H+]H3NCH2COOHH3NCH2COO-++H2NCH2COO-Gly+Gly+-Gly-H+K1H+K2酸性氨基酸，以Asp为例：Asp+Asp-Asp=Asp+碱性氨基酸，以Lys为例：Lys++（2）氨基酸的化学反应α-氨基参加的反应（a）成盐作用RCHCOOHNH2+HClRCHCOOHNH2HCl·（b）与HNO2的反应RCHCOOHNH2+HNO2RCHCOOHOH+H2O+N2↑（c）与甲醛的反应（d）酰基化反应及常用的酰基化试剂酰氯：RCHCOOHNH2+R'XRCHCOOHNHR'+HX苄氧酰氯（Cbz-Cl）:对甲苯磺酰氯(Tos-Cl)or5一二甲氨基萘-1-磺酰氯(dansylchloride,DNS):叔丁氧酰氯(Boc-Cl):CH2OCOClSClOOH3COCClOCCH3H3CCH3酸酐：邻苯二甲酸酐：COCOO（R’＝酰基）or+CH2OCOClH2NCHCOONaR在弱碱中（后酸化）Cbz-ClCH2OCONCHCOOHRH+Na++Cl-Cbz-氨基酸举例1：氨基酸与苄氧酰氯（Cbz-Cl）的反应氨基酸与5一二甲氨基萘-1-磺酰氯（dansylchloride,DNS）的反应H2NHCCOOHRNH3CCH3SOOCl+NH3CCH3SOOHNHCCOOHR+HClDNS-ClDNS-氨基酸举例2：（e）烃基化反应(f)与2、4一二硝基氟苯的反应2，4一二硝基氟苯RCHCOOHNH2+R'XRCHCOOHNHR'+HX（R’＝烃基）FO2NNO224H2NHCCOOHR+FO2NNO2在弱碱中DNFBHNHCCOOHR+F-O2NNO2DNP-氨基酸（黄色）(g)与苯异硫氰酸（酯）的反应H2NCCOOHR+在弱碱中NCSHPITCPTC-氨基酸PTH-氨基酸NCNCCHHOOHRHSH+NCNCCOHRHSα-羧基参加的反应（a）成盐和成酯反应H2NCCOOHRH+NaOH+C2H5OH干燥H2NCCOONa+H2ORHH2NCCOOC2H5+H2ORHHCl·HClYHNCHRCOOH+NO2HO酰化氨基酸对硝基苯酚YHNCHRCNO2OO+H2O酰化氨基酸对-硝基苯酯（活化酯）（式中Y＝酰基）（b）成酰氯反应YHNCHRCOOH+PCl5YHNCHRCClO+POCl3+HCl（c）成酰胺反应体外：RCHNH2COOC2H5+HNH2RCHNH2CNH2O+C2H5OH体内：Asp+NH4ATP酶Asn+（d）脱羧基反应RCHNH2COOH脱羧酶CO2+RCH2NH2↑COOH(CH2)2CHNH2COOH大肠杆菌脱羧酶COOH(CH2)2CH2NH2+CO2↑（e）叠氮反应RCHH2NCOOHRCHYHNCOOHRCHYHNCOOCH3NH2NH2（－CH3OH）RCHYHNCONHNH2HNO2RCHYHNCON3+2H2Oα-氨基和α-羧基共同参加的反应(a)茚三酮反应（b）成肽键RCHH3NC+O1+RCHNCOO2HH-OHH2ORCHH3NC+O1RCHNCOO2H-侧链R基参加的主要反应(a)-S-S-和-SH的氧化还原反应R-SH：HS-CH2CH2OH巯基乙醇（mercaptoethanol）HS-CH2COOH巯基乙酸（mercaptoaceticacid）HS-CH2(CHOH)2-CH2SH二硫苏糖醇（dithiothreitol,DTT）H2NCHCOOHCH2SSCH2CHCOOHH2N6HCOOOHH2NCHCOOHCH2SO3H2+6HCOOH2R－SHCHCOOHH2NCH2SH+R－S－S－R2（b）苯环的黄色反应phe+少量浓H2SO4+浓HNO3黄色TyrorTrp+浓HNO3黄色（c）酚基的Millon反应（米伦氏反应）HgNO3Tyr+Hg(NO3)2红色HNO3or（d）pauly反应His+重氮苯磺酸红色（棕红色）Tyr+重氮苯磺酸橘黄色（e）Folin一酚反应+磷钼酸Tyr磷钨酸Trp蓝色（钼蓝与钨蓝混合物）四氨基酸分析分离1．分配层析法的一般原理：分配系数Kd=CACBCA：一种物质在A相（流动相）中的浓度CB：一种物质在B相（固定相）中的浓度主要根据被分析的样品（如aa混合物）在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的目的，逆流分溶（逆流分配）2纸层析单向纸层析图Rf值双向纸层析图3薄层层析4离子交换层析原理：分离氨基酸时，用离子交换树脂作为支持物，利用离子交换树脂上的活