结核分枝杆菌实验室检测方法

结核分枝杆菌实验室检测方法分枝杆菌属•一类细长略带弯曲，有时呈分枝状的杆菌，本属细菌多具有抗酸性，又称抗酸杆菌（acid-fastbacillus），细菌体内含有分枝菌酸，细胞壁含有大量脂类，这与分枝杆菌的染色性、抵抗力和致病性等密切相关。•本属细菌已经被鉴定的有70多种，可分为三大类：结核分枝杆菌、非典型分枝杆菌、麻风分枝杆菌；•按生长速度可分为三类，即缓慢生长菌、迅速生长菌和不能培养菌三种类型结核分枝杆菌群•结核分枝杆菌，是人和动物结核病的病原体，包括人结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）、牛分支杆菌（M.bovis）、非洲分支杆菌（M.africanum）和田鼠分枝杆菌（M.microti），前三种对人类治病，其中人型结核分枝杆菌感染发病率最高。•结核分枝杆菌属于缓慢生长分支杆菌非典型分枝杆菌•偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌龟/脓肿、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶然分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、土分枝杆菌、草分枝杆菌、不产色分枝杆菌、海-溃疡分枝杆菌、金色分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌等•偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌龟亚种、龟分枝杆菌脓肿亚种属于迅速生长型，鸡蛋培养基上3-5天可见菌落•其他非典型分枝杆菌多为缓慢生长型麻风分枝杆菌•麻风分枝杆菌（M.leprae）是麻风病的病原体，也是抗酸杆菌，但较结核分枝杆菌短而粗，两端尖细，抗酸染色着色均匀，呈束状或团状排列，结核分枝杆菌多散在，偶有聚集。为典型的胞内寄生菌，有麻风杆菌存在的细胞胞浆呈泡沫状，称麻风细胞。•体外不能培养。•全球约有1/3的人口已经感染结核分枝杆菌，有2000万活动性肺结核患者，每年新发病例900万人，每秒钟有1人感染结核，每年有300万人死于结核病。•随着抗结核药物的不断发展和卫生生活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾一度大幅下降•20世纪80年代后，由于艾滋病和结核分枝杆菌耐药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、贫困及人口流动等因素，全球范围内结核病的疫情骤然恶化结核分枝杆菌6生物学形状结核分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌，有时可见分枝状，无芽孢和鞭毛，因衰老或抗结核药物的作用可出现多形态，如球状、串珠状或丝状，大小为1～4X0.4μm。细胞壁中含有大量脂质而不易着色，特别是有大量分枝菌酸包围在肽聚糖层的外面，一般用抗酸染色。萋尼染色呈红色，背景为蓝色；荧光染料金胺“O”染色，荧光显微镜下为橘黄色培养特性培养基•营养要求高，必须在含血清，卵黄，马铃薯，甘油及无机盐类的特殊培养基上生长，常用的有罗氏固体培养基培养条件•专性需氧，3%-5%CO2能促进其生长最适温度为35-37℃，最适pH为6.5-6.8菌落特点•菌落粗糙型，表面干燥成颗粒状，不透明，乳白色或淡黄色，菜花样8实验室检测方法•萋尼染色+荧光染色•罗氏培养+分枝杆菌快速培养•抗原抗体检测•细胞因子检测•荧光定量PCR•芯片杂交病原学免疫学分子生物学涂片镜检--抗酸染色•抗酸染色是目前为止最快的结核检出方法，可用来检测病情进展，为感染控制提供参考依据，可确证培养物为阳性•萋尼染色法—红色—普通显微镜（高倍）•荧光染色—黄或橘色—荧光显微镜（低倍）联染法：敏感性高，特异性好，速度快！抗酸染色局限性•抗酸染色对分枝杆菌非特异，其他如Nocardia（奴卡）、Rhodococcus（红球菌属）、Legionellamicdadei（军团菌）、cryptosporidium（隐孢子虫）、Isospora（等孢球虫）等有抗酸菌特点•不能区分结核和非结核分枝杆菌•不能区分活菌和死菌•敏感性差，一般1mL痰中有5000-10000条菌时可检出，而培养可检出10-100条菌.发光二极管荧光显微镜（LED）•荧光显微镜成本高、易损坏、耗电量大、光源寿命短、显微镜价格昂贵且需要在暗室内工作等，荧光染色法一直没有在结核病痰涂片诊断中得到广泛的应用。•只需将二极管替换普通光学显微镜的目镜就相当于一台荧光显微镜，组装的“荧光显微镜”结合金胺O染色在结核病痰涂片检查中有一定的应用价值。田斌等，发光二极管荧光显微镜在基层实验室诊断结核分枝杆菌的应用评价.实用预防医学2012年10月第19卷第10期.分枝杆菌培养技术•结核菌培养仍是目前诊断的金标准．尤其是药敏试验结果在指导临床用药及耐药性检测等方面具有重要作用,是鉴定是否为活菌的可靠方法．•1、传统的固态培养法需要4～6周才能检测到结核菌的生长．而且阳性率也只有30％-40％；特异性差．各种分枝杆菌均可生长。要确定是否为结核菌．需结合分枝杆菌菌种鉴定和药物敏感性试验。2、分枝杆菌快速液体培养技术•BD公司推出的BACTEC—MGIT960全自动分枝杆菌培养，鉴定／药敏系统，操作简便，阳性标本检出时间平均为9d：鉴定、药敏试验时间平均为4d：阳性标本检出率比传统固体培养提高10％左右固体培养和液体培养优缺点•固体培养：污染少，易于进行菌落形态观察，但是培养时间长•液体培养：菌体与培养基充分接触，生长迅速，但易受到污染血清学试验免疫学检测方法•1、结核菌素试验•凡感染过结核杆菌的机体，会产生相应的致敏淋巴细胞，具有对结核杆菌的识别能力，当再次遇到通过皮肤注入的少量的结核菌素时，致敏Ｔ淋巴细胞受相同抗原再次刺激会在48-72小时内，产生局部炎症反应，出现红肿硬节即为阳性反应。•对活动性结核的诊断灵敏度高达77％，局限性：•假阴性：•小儿结核、老年人结核、免疫缺陷或免疫功能低下患者（如合并HIV感染、接受免疫抑制剂治疗的患者)•假阳性：•接种过卡介苗的人也会产生阳性反应γ干扰素释放试验被认为是近十年来结核诊断史上取得的最重要成就，该检测方法的原理是：结核感染后体内长期存在抗原特异性的记忆性Ｔ细胞，当再次遇到抗原刺激时，能迅速活化增值，释放γ干扰素。•目前市售两种，QFT-G和T-SPOT.TB，比较两种方法，T-SPOT.TB更灵敏但QFT-G更特异，但均优于结核菌素试验，同时也被推荐用于潜伏结核诊断。分子生物学检测方法•近年来核酸扩增技术和杂交分析技术的发展，为分枝杆菌的检测、鉴定和药敏实验提供了极大的方便，可将诊断时间从几周降低到几天。研究、应用报道较多的结核病基因诊断技术主要包括聚合酶链反应(PCR)、核酸探针杂交、DNA序列测定、基因芯片、基因分型等。分枝杆菌核酸检测分枝杆菌菌种鉴定结核分枝杆菌耐药基因检测MDR早期诊断分枝杆菌分子诊断系统（协和医院）菌种鉴定筛查、鉴别诊断实时荧光PCR基因芯片快速检测平台高效：一个样本可同时检测结核分枝杆菌和NTM快速：4周（菌培）3小时灵敏：10个菌/反应（TB）；102个菌/反应（NTM）22分枝杆菌核酸检测功能：TB快速筛查；TB/NTM鉴别诊断高效：同时检测17种分枝杆菌（包括TB）快速：＞4周（菌种鉴定）6小时灵敏：103个菌/反应检测范围：结核、胞内、鸟、戈登、堪萨斯、偶然、瘰疬、浅黄、土、龟-脓肿、草、不产色、海-溃疡、金色、苏尔加、蟾蜍、耻垢。23分枝杆菌菌种鉴定（DNA微阵列芯片法）通量：两个一线抗结核药（MDR）速度：8周（药敏）6小时灵敏度：103个菌/反应基于rpoB（利福平）和katG/inhA（异烟肼）的基因突变，对耐多药结核病做出快速诊断。24结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒高会霞等，五种结核病实验室检测方法对结核病诊断价值的效果评价.实用检验医师杂志，2012，4（3）：157-160.五种结核检测方法效果评价结核组：1260例非结核组：100例改良罗氏培养荧光PCR涂片法MGIT960快速培养结果比较斑点层析法敏感性、特异性比较罗氏培养和快速培养快速培养和荧光PCR总结：•涂片简单快速但阳性率较低、难以区分结核和非结核分枝杆菌•培养为金标准，但需时较长•血清学试验检测结核抗原或抗体不太理想•γ干扰素释放试验能较好地为临床服务•荧光PCR检测结核分枝杆菌具有较好的敏感性和特异性，可结合传统方法综合分析!