内标的选择

内标的选择为什么要用内标法内标法指选择样品中不含有的纯物质作为对照物质加入待测样品溶液中，以待测组分和对照物质的响应信号之比为定量依据，测定待测组分含量的方法。1.体内药物分析的特点（1）药物浓度低（2）内源性杂质干扰样品预处理是必经步骤2.在预处理过程中,提取时通常不采用反复提取的方法，多半只进行一次（至多两次）提取，一般并不考虑“提取尽药物”。3.要达到样品定量测定的目的，提取溶剂必须精确加入，提取液要定量转移，在以后的各个阶段，如蒸发、溶解以及衍生化、进样操作中也要尽可能一致，才能确保各份样品提取率一致4.在实际操作中，往往难于达到每次操作的完全平行，因而会引入较大的误差。这种情况下，采用内标法定量就很有必要内标的基本要求1.供选作内标的化合物或药物,其理化性质必须和被测组分十分相近例如，内标在水相和有机相中的分配情况、挥发性、对萃取容器的吸附性以及层析行为等应与被测组分相似。分配行为与挥发性近似，才能保证与被测组分有平行的回收率；层析行为相近，其保留时间、峰形才能与被测组分近似，二者峰面积（或峰高）比值才恒定2.内标的色谱峰应靠近被测组分的色谱峰，最好位于几个被测组分色谱峰的中间，但又能完全分离3.内标浓度的选择一般内标加入量应控制在使标准曲线中段的药物与内标物响应值（注意不是浓度）比近似为14.对内标的纯度要求从实际应用角度出发，不苛求内标具有高纯度与高含量，只要求在同一次测定中，标准曲线和样品各管内内标加入量相等5.内标物能很好地溶解在样品中，但不能与样品发生化学反应6.供作内标的化合物不应当是体内的内源性成分，或药物在体内可能产生的代谢物，并且最好不用患者可能同时使用的其他药物HPLC为分析方法时内标的选择一般选择化学结构与被测药物相似的另一种药物或化合物作内标，具体可从以下几个角度考虑1.内标与被测药物只相差一个化学元素例如，测定血浆中的5－氟尿嘧啶（5－FU）时，可用5－氯尿嘧啶（5－CU）作内标2.内标与被测药物为同系物例如,测定血中乙醇含量时，可用丙醇作内标3.内标物与被测物结构相似（应用最多的方法）例如，体液中抗癫痫药物苯巴比妥的测定，常选用化学结构相似的扑米酮作为内标4.少数情况下，也可以选择结构不相似的化合物或药物作为内标，但其理化性质也必须与被测药物相近例如，曾经泽等在用RP－HPLC测定口服苯妥英钠后尿中对羟基苯妥英（P-HDPH）含量时，选择了一般化学试剂对硝基酚作内标GC为分析方法时内标的选择应用GC进行体内药物分析时，内标的选择基本与HPLC中相同，但由于GC法本身的一些特点，相应带来一些必须考虑的因素1.内标物必须有一定的挥发性，在所选择的GC条件下能够气化2.GC测定一般需要在120度以上柱温条件下进行，因此内标必须是遇热稳定的3.GC中，衍生化经常是必需的，内标物必须和待测组分发生相同的衍生化反应4.GC测定时若采用氮－磷检测器（NitrogenPhosphorusDetector，NPD）或电子捕获检测器（ElectronCaptureDetector，ECD）时内标仅仅与待测物结构相似还不够，必须相应地含有N（P）或卤素原子，才能被检测器所检测到例如，用GC测定血清中的氯丙嗪时，采用的是ECD检测器，此时若采用丙嗪作内标，虽然结构很相似，但由于丙嗪分子结构中无电子亲和性很强的氯元素，因此对ECD不敏感，不能产生色谱峰MS作为检测器时内标的选择内标在GC－MS、LC－MS中的作用完全与应用于GC、HPLC中的内标相同，内标选择的方法既有相似之处，也有本身的一些特点1.选择与被测药物结构相近的另一种药物或化合物作为内标选择的方式以及对内标的要求与色谱法完全相同。例如，用GC－MS测定血浆中的利多卡因及其代谢物去乙基利多卡因浓度时，可选择三甲卡因作为内标2.选择与被测物具有相同质荷比离子的化合物作为内标由于在质谱检测时，内标与药物都具有相同质荷比的特征离子，因此检测时就可进行单离子监测，不仅可提高灵敏度，而且可简化操作内标和待测物虽具有相同的m/z，但因为先经GC柱分离，到达MS就有先后，故可被MS分别检测，不会相互干扰由于只进行单离子监测，特征离子聚焦在检测器上的时间增多，提高了测定的灵敏度，尤其适于测定药浓低的生物样品MS作为检测器时内标的选择3.选择稳定性同位素标记药物作为内标MS作为色谱方法的检测器，与一般检测器不同，具有按离子质量差异而将其在质谱上分开的功能，因此可选择稳定性同位素标记药物作为内标由于内标（稳定性同位素标记药物）同被测药物化学结构相同，仅个别元素是质量不同的同位素，因此二者的理化性质更为接近，能充分发挥内标在样品预处理过程中的作用可用于标记的稳定性同位素有2H、13C、15N、18O和37Cl等，其中后四种同位素标记的药物虽然其理化性质更接近原药，但价格贵，标记时采用的化学反应也复杂，实际应用较少。相对而言，2H（Deaterium，常简写为D或d）是标记时常用的稳定性同位素应用时亦需注意:虽然MS可按质量差异将质谱离子分开，但也要求标记的稳定性同位素有足够数量，即标记药物比原药至少应多3个质量单位才易分开。当2H标记时也不能标记得太多，一般以标记3－5个2H为宜，若标记太多，则标记物的理化性质可能会显著偏离原药（同位素效应），削弱了内标应有的作用MS作为检测器时内标的选择使用稳定性同位素标记药物作为内标有许多优点(1)因为内标与被测组分是同一化合物，仅是分子量大了1－3个质量单位，其他的化学性质和物理性质都是相同的，所以在一般情况下不可能被色谱分离（即保留时间相同），也没有必要分离开，因为用MS检测时，内标和被测药物选择监测离子存在质量差异，能被MS分离并分别检测。可以简化色谱条件(2)可以进一步确证样品当使用同位素标准品后，由于待测组分与氚代或13C代标准品是同一种物质，所以二者同种离子的丰度比应该相同这样可进一步确证化合物例如，确定可卡因的代谢产物苯甲酰爱冈宁时，除用计算机解析得到苯甲酰爱冈宁的几个可能结构外，还可用待测组分的m/z210（丰度为100％）、272（34％）、331（62％）和氚代标准品m/z213（100％）、275（34％）、334（62％）来确证，这样误判率就会极小(3)稳定性同位素原子核不会自发放出射线，无辐射性伤害和放射性污染内标的评价用内标法定量时选择合适的内标有极其重要的意义，但选择的内标是否合适应有客观的判断标准。下面介绍几种评价内标的方法1.用若干含药物与内标量比例相同的的溶液直接进样，以峰高比是否恒定来评价此法采用药物和内标的纯品作试验，未考察其在生物基质中经预处理后的情况，实验结果仅具有一些参考价值，但对于确定加入内标的合适量有一定意义2.采用测定药物与内标自空白血浆中回收率的相关性，以此来评价内标是否合适例如，1978年Mcallister用GC测定血浆中安定浓度时，选择了与安定结构相近的普拉西泮和去甲羟安定作内标，实验中考察了经相应处理后安定和内标自血浆中的回收率，作出安定与普拉西泮（内标1）和安定与去甲羟安定（内标2）回收率的相关性用普拉西泮作内标时，因其结构与安定相近，二者的回收率相关性很好（r=0.84）,血浆样品测定结果有较高的准确度，误差在7％以内。相反，若用去甲羟安定作为内标，因其化学结构中增加了一个极性大的羟基，故理化性质与安定有较大的差异，在同样条件下它的回收率与安定相差较大，相关性很差（r＝0.19），导致血浆中安定测定的误差达50％内标的评价内标的评价3.用误差传递规律判断内标是否改善分析方法的精密度1981年Haefelfinger提出了这种比较系统的、有数值指标可供判断的内标评价简便方法。经过一系列的推导，可得出两个判断内标是否改善分析方法精密度的数学式:RSDQRSDa或RSDb2rRSDa其中RSDa、RSDb、RSDQ是指含药物和内标的同一样品多次重复分析时，每次得到的样品的峰响应值、内标的峰响应值、药物与内标的峰响应值之比的相对标准差r：药物峰响应值组与内标峰响应值组的相关系数。例如，于某含药物的血浆样品中加入内标，经沉淀蛋白后取上清夜直接满环进样，用RP－HPLC测定（进样环20ul），得到的数据如右表:由表知RSDa（0.82％）反而较RSDQ（0.87％）小，因此采用内标法不能改进分析方法的精密度。药物峰高组与内标峰高组的相关系数r值为0.496，可得RSDb2rRSDa,也表明不能改进分析方法的精密度多内标法下列两种情况下可考虑采用多内标法1.样品中需同时测定的组分较多，并且它们各自之间保留时间差别较大有的样品含多种药物，或含一种药物但含多种代谢物，这些被测组分之间理化性质差异较大，导致出峰时间及峰形差异也较大，若仅使用一种内标，则常常其保留时间及峰形不能满足所有组分。这种情况下，可考虑使用两个内标，其保留时间一前一后，分别用于出峰早的和出峰晚的被测组分峰的定量，以提高分析方法的精确度和准确度2.样品中被测组分的浓度相差较大样品中有时含两个被测组分（如药物与代谢物）浓度差别较大，则难于确定内标加入量。若加入量较多，虽能满足高浓度组分，使其与内标响应值之比在合适范围内，但会导致低浓度组分与内标的峰响应值之比太低；反之，若减少内标加入量以满足低浓度组分，又会导致高浓度组分与内标的响应值之比偏高这种情况下，可以往样品中同时加入多个内标，如加入两个内标（称双内标法），其中一个内标的加入量较多，可以作为样品中浓度高的药物之定量用，另一内标则加入量较少,专门用于低浓度药物定量实际工作中的几点体会1.首先看看自己实验室现有的标准品中有哪些与被测物的结构相似,在所选择的波长处有吸收；另外可查查拟选择的内标的文献报道的分析方法，比较与初步确定的待测样品的色谱条件是否相似2.当遇到某药物为合适的内标，却无原料药物可供使用的情况时，可从该药物的制剂中提取，并适当精制处理。只要无干扰分析的杂质存在，组成稳定，即可供作内标使用3.当采用梯度洗脱程序时，待测物和内标应在梯度程序的同一段中出峰4.在LC－MS、GC－MS作为分析方法时，由于雾化效率、离子化效率等等总是处于波动之中，重现性不及HPLC，所以内标的选择更为必要和关键，必须注意内标质谱行为的稳定性实际工作中的几点体会5.影响内标和被测组分峰高或峰面积比值的因素主要有化学方面的、色谱方面的和仪器方面的三类由化学方面的原因产生的面积比的变化常常在分析重复样品时出现，包括：（1）、内标物在样品里混合不好（2）、内标物和样品组分之间发生反应（3）、内标物纯度可变等对于一个比较成熟的方法来说，色谱方面的问题发生的可能性更大一些，色谱上常见的一些问题(如渗漏)对绝对面积的影响比较大，对面积比的影响则要小一些，但如果绝对面积的变化已大到足以使面积比发生显著变化的程度，那么一定有某个重要的色谱问题存在，比如进样量改变太大，样品组分浓度和内标浓度之间有很大的差别，检测器非线性等。进样量应足够小并保持不变，这样才不致于造成检测器和积分装置饱和如果认为方法比较可靠，而色谱方面看来也是正常的话，应着重检查积分装置和设置、斜率和峰宽定位。对积分装置发生怀疑的最有力的证据是：面积比可变，而峰高比保持相对恒定6.在LC-MS的测定过程中，有可能发现在标曲中随着药物浓度的增高，其与内标的面积比漂移，标曲的线性甚至都不及不加内标时。这有可能是由于基质效应的存在两个与内标有联系又必须相互区别的概念1.生物内标本文所讨论的内标仅仅指通常讲的“分析内标”。而生物内标是指将标记药物与未标记药物一同用于人体，以消除由于不同时间给药引起的个体内误差，测试药物在临床特定情况下的药代动力学特征。这是的标记药物成为“生物内标”。2.分析载体分析载体(analyticalcarrier)是在样品测定前外加的一种药物或化合物,主要用于增加药物在预处理过程中的绝对回收率,由此间接提高分析方法的精密度。分析载体与内标的作用显然不同,但从二者的选择与应用来看,有许多相似之处及共同点。具体可参阅相关文献。小结内标的选择是一项看似简单实则不易的工作。只有在掌握扎实的理论