SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质实验一.实验目的•学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。•掌握垂直板电泳的操作方法。•运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。实验器材•垂直板电泳装置•直流稳压电源•移液管•滤纸•微量注射器•大培养皿•使用含有十二烷基硫酸钠（SDS）和还原剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸3～5分钟），通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。同时还原剂可以切断蛋白质中的二硫键（使二硫键还原）。•经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连接的，分离的状态。由于SDS是带有负电荷的分子，同时它有一个长的疏水尾巴，SDS通过疏水尾巴与肽链中的氨基酸的疏水侧链结合，结合SDS的比率大约是一个蛋白质分子中每两个氨基酸残基结合一分子的SDS。实验原理蛋白质在净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素•电荷因素蛋白质分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同•分子大小蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不同•分子形状蛋白质分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同电荷因素分子大小分子形状凝胶总浓度及交联度对凝胶的影响•凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚丙烯酰胺凝胶特性包括其机械性能、弹性、透明度、粘着度及孔径大小的主要因素。T为凝胶溶液中单体和交联剂的总质量浓度，C为凝胶溶液中交联剂占单体和交联剂总量的质量分数。式中，a为丙烯酰胺单体的质量(g)，b为交联剂的质量(g)，m为溶液的终体积(mL)。•凝胶a、b的比例决定了凝胶的物理性状。当a:b小于10时，凝胶脆且硬，不透明，呈乳白色；当a:b大于100时，即使用5%的丙烯酰胺凝胶也呈糊状；通常用a:b在30左右，并且丙烯酰胺浓度高于3%，凝胶富有弹性并且透明。%100mbaT%100babC聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型连续系统是指电泳系统采用相同孔径的凝胶、缓冲系统等条件下进行区带电泳，是利用蛋白质分子的电荷效应进行分离，凝胶的分子筛效应不明显，一般只用于分离一些比较简单的样品，缺点是分辨率不高。优点是制胶简单快捷，缓冲系统的pH恒定，可以防止样品进胶后因pH变化发生凝聚和沉淀，缓冲系统组成简单。不连续系统是指使用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳方式，在电泳分离过程中，由于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，对样品进行浓缩，然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离，既存在电荷效应，也有分子筛效应。虽然制胶操作难度较大，但是它具有连续系统不可比拟的优越性，分辨率高。不连续电泳的四个不连续性凝胶浓度的不连续性；缓冲液离子成分的不连续性；缓冲液pH梯度的不连续性；电位梯度的不连续性。化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶，重复性好。聚合反应受各种因素的影响：•催化剂和加速剂的浓度应选择合适的AP和TEMED浓度使聚合时间控制在30—60min内较好，过量的催化剂和加速剂会引起烧胶和蛋白质条带的畸变。•pHTEMED只能以游离碱的形式发挥作用，在酸性条件下，叔胺缺少自由碱基，引发AP产生自由基的过程会被延迟，聚合时间延长。••温度聚合速度与温度有关，一般是高温聚合快，而聚合的速度影响交联孔径的大小，所以凝胶聚合时必须保持温度恒定，通常用与电泳相同的温度。••分子氧分子氧的存在会阻止碳链的延长，妨碍聚合作用，在聚合过程中要尽量避免接触空气。••杂质某些金属离子或其它杂质也会影响凝胶的化学聚合，所以应选择高纯度的Acr、Bis和AP。实验过程1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,准备2个干净的锥形瓶.2.把玻璃板在灌胶支架上固定好.※固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板.用琼脂封板。3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置40分钟.※凝胶配制过程要迅速,催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡.实验过程※水封的目的是为了使分离胶上延平直，并隔绝空气※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面.4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟.※样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平.实验过程5.在上槽内加入缓冲液后,拔出样梳。※要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果.6、加样（1）取10µl标准蛋白溶解液于EP管内，再加入10µl2倍样品缓冲液，上样量为10µl。（2）取10µl样品溶液，再加入10µl2倍样品缓冲液，上样量分别为5µl和3µl。7.用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。※注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散.※为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样.实验过程8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分.11.实验结果分析。思考题•在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么?•样品溶解液中各种试剂的作用是什么?•在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用?注意事项（1）安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，避免缓冲液渗漏。（2）用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。（3）样品中应含一定浓度的蔗糖溶液，目的是用以防止样品因对流而被稀释。（4）加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。注意事项•丙烯酰胺具有中等毒性。常人每天允许的最大暴露量不超过0.5μg/kg，皮肤接触可致中毒，症状为红斑、脱皮、眩晕、动作机能失调、四肢无力等。•丙烯酰胺是神经毒剂，可以透过皮肤•不要接触皮肤，戴手套、口罩操作注意事项•没有聚合的丙烯酰胺不要倾倒到水源附近•一定要催化充分，使之完全聚合•集中处理，实验中全部的胶由专门受过训练的人收集到一起，在一个特殊标明的容器中保存，并进一步催化使之反应完全，最后送交学校危险品仓库，统一处理。注意事项•聚丙烯酰胺通常认为无毒，但是也要小心操作，因为其中可能留下少量没有聚合的单体。•保护实验仪器，不得损坏。凝胶浓度的计算•聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔径大小均取决于两个重要参数T和C，T是丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。C是与T有关的交联百分浓度。T与C的计算公式是：•上式中a为丙烯酰胺的克数，b为甲叉双丙烯酰胺的克数，m为水或缓冲液体积（ml）。式中a与b的比例很重要。富有弹性，且完全透明的凝胶，a与b的重量比应在30左右。％1001babC％1001babC％1001babC（％）＋100babC％(100mbaT％(100mbaT％(100mbaT％(100mbaT％(100mbaT％(100mbaT％(100mbaT％(100mbaT％(100mbaT％(100mbaT％(100mbaT％(100mbaT％(100mbaT）图1聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.7(2)浓缩胶pH6.7(3)分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.3图2夹心垂直板电泳槽示意图图3凝胶模示意图1.样品槽模板2.长玻璃板1.导线接头2.下贮槽3.凹形橡胶框4.样品槽模板5.固定螺丝6.上贮槽7.冷凝系统返回垂直板电泳装置加样样品迁移方向电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。混合样品带孔胶按分子大小分离电泳方向电泳小分子大分子夹在两块玻璃板之间的凝胶电泳缓冲液电泳缓冲液加在槽中的经SDS处理的样品分子量小分子量大电源电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片标准蛋白分子量未知蛋白在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量。相对迁移率水平式电泳装置电泳缓冲液凝胶