实验五 质粒DNA酶切(质粒限制性内切酶消化酶切)

质粒DNA酶切（质粒限制性内切酶消化酶切）实验五背景知识一、质粒图谱的阅读二、限制性内切酶第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。Ampr水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。tetr可以阻止四环素进入细胞。camr生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活hygr使潮霉素β失活。一、质粒图谱的阅读第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。第五步：是否含有表达系统元件，即：启动子——核糖体结合位点——克隆位点——转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体的。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。pCAMBIA130210549bpKanHPTGFPT-DNArightborderT-DNAleftborderpUC18MCSNOS35Spromoter35SpromoterpVS1-REPpBR322oriUTRUTRlacZpromoterEcoRV(6218)EcoRV(8842)EcoRV(10442)农杆菌复制起始位点大肠杆菌复制起始位点加尾信号，终止位点潮霉素抗性基因多克隆位点终止子加尾信号绿色荧光蛋白基因二、限制性内切酶1)概念2)命名原则3)类型4)基本特性及用途5)影响核酸限制性内切酶活性的因素6)Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项1)概念限制性核酸内切酶(restrictionednonuclease)是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的内切核酸酶（endonuclease)的总称。至2006年2月共发现3773种限制性内切酶，I、II、III型各有68、3692、10种，甲基化指导的3种，商品化的609种，II型中共有223种特异性。2)命名原则•1973年H.O.Smith和D.Nathams首次提出命名原则，1980年Roberts在此基础上进行了系统分类①限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名(genus)；第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)。②第四个字母代表宿主菌的株或型(strain)。③若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。属名种名株系Haemophilusinfluenzaed流感嗜血杆菌d株HindⅡHindⅢ同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶3)类型据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三类。主要特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制修饰蛋白结构辅助因子识别序列切割位点应用多功能异源三聚体ATP、Mg2+、SAM距识别序列1kb处随机性切割不常用单功能同源三聚体Mg2+4~6bp回文序列识别序列内或附近特异切割常用双功能异源二聚体ATP、Mg2+距识别序列下游24~26bp处随机性切割数量很少，无实际作用4)基本特性及用途Ⅱ限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′端为OH，识别序列一般为4～6个碱基对，通常是反转录重复顺序，具有180°的旋转对称性即迴文结构。Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口。5′粘性末端3种切口3′粘性末端平头末端Ⅱ限制性核酸内切酶的主要用途①在特异位点上切割DNA，产生特异的限制性酶片段。②建立DNA分子的限制酶图谱。③构建基因文库。④用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。⑤改建质粒。5)影响核酸限制性内切酶活性的因素①DNA样品纯度②DNA样品甲基化程度③酶的星活性(staractivity)①DNA样品纯度A）样品杂有RNA虽不影响酶反应速度，但RNA很易与酶蛋白发生非特异性结合而减少酶有效浓度，使酶解不彻底；另外，干扰DNA片段电泳观察。B）少量的蛋白质污染对酶解影响不大，但若有核酸酶等蛋白质污染时，会干扰酶切反应，并影响酶解产物。C）样品中杂有其他DNA如质粒DNA中杂有染色体DNA，虽不影响酶解作用，但干扰酶解产物电泳图谱并影响以后的重组连接反应。D）其他杂质如苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，会影响酶切速度，甚至改变酶的识别特异性，出现酶的第二活性。②DNA样品甲基化程度限制性内切核酸酶的识别序列若被修饰酶产生了修饰反应，则该DNA不能被限制酶再切割。DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一，DNA甲基化现象广泛的存在于原核和真核生物中。如：AccⅠ识别序列能切割不能切割注意此处的区别dam甲基化酶识别序列AccⅠTCCGGAGAT×CCGG6mATC采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA，可防止DNA的甲基化。③酶的星活性(staractivity)又称第二活力，是指改变了酶切反应条件后特异序列识别特性降低的一种现象。由于识别特异性的降低，可能对原识别序列相似的序列也产生切割反应。高浓度甘油、高pH、低离子强度、巯基乙醇、DMSO、Mn2+等的存在可能导致酶产生星活性。6)Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项①商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次操作时应使用新的吸头去取酶；加入酶的体积应不超过总体积的10%，否则酶液中的甘油浓度超过5%时酶易产生星活性。②整个操作应在0℃进行，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，最后加入酶。③当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间，减少酶的用量。④当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液；若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。实验目的１）了解酶切原理，掌握酶切体系建立原则２）用EcoRⅤ切割质粒pCAMBIA13023）用EcoRⅤ切割银杏基因组DNA实验原理•限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。限制性内切酶EcoRⅤ特异性识别位点为：GATATCCTATAGGATATCCTATAG产生平末端：pCAMBIA130210549bpKanHPTGFPT-DNArightborderT-DNAleftborderpUC18MCSNOS35Spromoter35SpromoterpVS1-REPpBR322oriUTRUTRlacZpromoterEcoRV(6218)EcoRV(8842)EcoRV(10442)则pCAMBIA1302经EcoRⅤ酶切后产生大小分别为：1600bp、2624bp和6325bp的三条DNA片段基因组DNA中由于有较多的EcoRⅤ识别位点，因此，经EcoRⅤ酶切后产生大小不一的条带，电泳后整个泳道呈现均一的亮带。酶切前的DNA酶切后的DNA实验材料和试剂实验材料：质粒pCAMBIA1302银杏基因组DNA实验试剂：①EcoRⅤ酶及其酶切缓冲液②琼脂糖(Agarose)、TAE电泳缓冲液等实验仪器恒温水浴锅质粒（DNA）17.5μL反应10×缓冲液2μL19μL0.5μL酶液+用移液枪轻轻吹打使溶液混匀，且使溶液集中在管底混匀反应体系后，37℃水浴保温4-5h１％琼脂糖凝胶电泳检测(上样10μL电泳)EP管编号,加样实验步骤实验注意事项1.限制性内切酶用量可按标准体系1μgDNA加1单位酶，消化1-2h。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。2.酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。3.市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则酶活性将受影响。思考题如果一个DNA酶解液在电泳后发现DNA未被酶切或者酶切不完全,你认为可能是什么原因？