引物设计及测序结果分析-PPT(精)

第四章PCR引物设计及测序结果分析Content聚合酶链式反应（PCR）的技术原理及结果分析PCR引物设计原理及相关软件的使用（PrimerPremier5.0）测序结果分析一.PCR的技术原理及结果分析聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。PCR不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。PCR技术原理以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。正义链反义链基本分子生物学研究手段PCRPCR反应液体的成分:PCR循环的程序:PCR原理：基本分子生物学研究手段RT-PCR反转录PCRmRNA---cDNA-----PCR基本分子生物学研究手段Cuttingbyenzymes基本分子生物学研究手段SouthernBlot基本分子生物学研究手段NorthernBlotPCR技术的基本过程模板DNAdNTP引物Buffer预变性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶循环仪94oC5’94℃55℃72℃模板与引物的复性,引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。Tm在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA94˚C从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，按5’→3’的方向沿着模板顺序合成新的DNA链72˚C变性退火延伸PCR出现的问题：PCR扩增未得到目的条带？扩增出目的条带之外的多条带（非特异性）？扩增的目的条带很弱？引物是否合适?引物设计是PCR技术中至关重要的一环PCR结果分析PCR结果。1－2、PCR产物（3ul样品）PCR常见问题1.无扩增产物模板:含有抑制物，含量低Buffer对样品不合适引物设计不当或者发生降解退火温度太高2.非特异性扩增引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多退火温度偏低循环次数过多3.拖尾产物在凝胶上呈Smear状态M12模板不纯或降解Buffer不合适退火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2+浓度偏高循环次数过多4.假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)交叉污染对策操作时防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除不能耐高温的物质外，所有试剂器材均高压消毒。离心管及枪头等一次性使用。各种试剂先进行分装，低温贮存。设置阳性和阴性对照，重复实验1、目的基因的克隆：PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法。2、基因的体外突变：可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。PCR的应用3、DNA和RNA的微量分析：PCR技术高度敏感，对模板ＤＮＡ的含量要求很低，是DNA和ＲNA微量分析的最好方法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。4、基因转录水平检测RT-PCR可检测不同组织或细胞中基因的转录水平.5、基因突变分析：利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。二.PCR引物设计原理及相关软件的使用（PrimerPremier5.0）引物引物的重要性引物设计的原则引物同源性分析引物设计软件如何使用PrimerPremier5.0酶切位点及保护碱基的添加引物（primers)引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。(上游引物与DNA序列一致,下游引物要反相互补.)→←3’3’5’5’SenseprimerAntisenseprimer引物的重要性在整个PCR体系中,引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。引物设计原则引物长度碱基分布的均衡性Tm值引物二级结构引物3’端引物5’端引物的内部稳定性引物的保守性与特异性扩增区域的二级结构引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。基本原则：一般原则：1.引物的长度：配对引物的长度一般在15-30bp之间比较合适。尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过5℃）Tm值的计算：一般的公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)2.引物的GC%含量：一般为40%-60%。上下游引物的GC含量不能相差太大。3.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。4.引物3’端的末位碱基避开密码子的第3位，且最好不选择A5.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。6.引物无回文对称结构，否则会形成发夹结构；引物自身不能配对，否则易形成约两个引物长度的引物二聚体；发夹结构引物二聚体7.引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基）。5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。8.引物的保守性与特异性保守性：通用引物——检测同一类病原微生物尽可能多的型别特异性：避免非特异性扩增引物同源性分析用Blastn软件进行同源性比较尽可能选择与非目的基因同源性小的序列作为引物选择3’端与非目的基因不同源的序列作为引物引物设计软件PrimerPremier5.0生物软件网下载安装后，用文本编辑器打开WIN.INI，将vspace=DU改为vspace=PU便可以使用全部功能。Oligoprimer3ThePrimerGeneratorNetPrimer如何使用PrimerPremier5.0引物设计一般引物设计5’带酶切位点引物设计巢式PCR引物设计多重PCR引物设计探针设计引物评析PrimerPremier5.0主要功能:1、引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析PrimerPremier5.0使用介绍PreimerPremier启动界面Loadsequence’引物位置范围3’引物位置范围产物大小范围引物长度搜索结果28对引物引物分值100分为满分每对引物的信息双击选中一对引物引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer引物编辑引物编辑编辑引物分析引物结果确认编辑的引物基因克隆重组DNA质粒DNA基因片段酶切位点及保护碱基的添加酶切位点的查找酶切位点的选择原则:1.DNA序列当中不含有该酶切位点.2.载体中只在多克隆位点含有该酶切位点.3.按照酶切位点在多克隆位点中的顺序分别将选用的酶切位点放在上下游引物中.4.尽量选择粘性末端的酶切位点.5.在有多种选择的情况下,选择便宜且酶切效果好的.