微生物实验指导书-

1微生物学实验指导书2目录实验一玻璃器皿清洗、包扎与常用灭菌技术...................................................................3实验二培养基的配制...........................................................................................................8实验三从土壤中分离微生物及纯化.................................................................................11实验四微生物的接种技术.................................................................................................14试验五细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的形态观察.........................................................17实验六细菌的简单染色和革兰氏染色.............................................................................20实验七大肠杆菌生长曲线的测定.....................................................................................23实验八实验室环境和人体表面微生物的检查.................................................................25实验九乳酸菌的检测.........................................................................................................283实验一玻璃器皿清洗、包扎与常用灭菌技术【目的要求】1.学习并掌握棉塞制作的目的、原理及方法；2.学习并掌握玻璃器皿清洗及包扎方法；3.掌握高压蒸汽灭菌的基本原理及操作方法。4.了解其它常用消毒灭菌技术原理及技术【基本原理】棉塞的作用有二：一是防止杂菌污染，二是保证通气良好。因此，棉塞质量的优劣对实验的结果有较大的影响。微生物学实验所用的器皿，大多数要进行清洗、消毒、灭菌，才能用来培养微生物。玻璃器皿的包扎方法正确合理，在使用过程中才能有效防止杂菌的污染。玻璃器皿包扎好后，一般用高压蒸气灭菌法进行灭菌。高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到100℃以上的高温，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。此外，常见灭菌方法还有干热灭菌、灼烧灭菌、紫外线灭菌、过滤除菌等。对空间灭菌常使用甲醛加高锰酸钾熏蒸、喷洒消毒灭菌药剂等消毒灭菌方法。【实验用品】棉花，试管，培养皿，纱布，三角瓶，棉线，量筒，牛皮纸（或旧报纸），LDZX-50KBS立式高压蒸气灭菌锅，常用灭菌用具、药剂等等。【方法步骤】一、棉塞的制作正确的棉塞要求形状，大小，松紧与试管口（或三角瓶口）完全适合，过紧妨碍空气流通，操作不便；过松则达不到滤菌的目的。制作过程见图1，包括取棉花、整理、折角、卷紧、成形、塞试管等步骤。塞上棉塞时，应使棉塞长度的1/3在试管口外，2/3在试管口内。4A.内部框架B.带盖外筒图3培养皿金属灭菌筒图1棉塞制作过程做棉塞的棉花要选纤维较长的，一般不用脱脂棉做棉塞，因为它容易吸水变湿，造成污染，而且价格昂贵。此外，在微生物实验和科研中，往往要用到通气塞，即用几层纱布（一般8层）相互重叠而成，或是在两层纱布间均匀铺一层棉花而成。这种通气塞通常加在装有液体培养基的三角烧瓶口上。经接种后，放在摇床上进行振荡培养，以获得良好的通气促使菌体的生长或发酵，通气塞的形状如图2。A.配制时纱布塞法；B.灭菌时包牛皮纸；C.培养时纱布翻出图2通气塞二、玻璃器皿的清洗1.不能用有腐蚀性的化学试剂，也不能使用比玻璃硬度大的物品来擦拭玻璃器皿；新的玻璃器皿应用2%的盐酸溶液浸泡数小时，用水充分洗干净。2.用过的器皿应立即洗涤。3.强酸、强碱、琼脂等能腐蚀、阻塞管道的物质不能直接倒在洗涤槽内，必须倒在废液缸内。4.含有琼脂培养基的器皿可先将培养基刮去，或用水蒸煮，至培养基融化后倒出，然后再用洗洁精清洗。凡遇有传染性材料的器皿，应经高压蒸汽灭菌后再进行清洗。5.一般的器皿可以用去污粉、肥皂或洗洁精清洗，油脂很重的器皿应先将油脂擦去。沾有煤膏、焦油及树脂一类物质，可用浓硫酸或40%氢氧化钠或用洗液浸泡；沾有蜡或有油漆物，可加热使之熔融后揩去，或用有机溶剂（苯、二甲苯、汽油、丙酮等）揩去。6.载玻片或盖玻片，先擦去油垢再清洗干净，然后在稀的洗液里浸泡2小时，用清水冲净，最后用蒸馏水冲洗，干后浸于95%酒精中保存备用。7.洗涤后的器皿应达到玻璃壁能被水均匀润湿而无条纹和水珠。三、玻璃器皿的包装1.培养皿的包装培养皿常用旧报纸紧紧包裹，一包7～10套，包好后干热或湿热灭菌。如果将培养皿放入金属筒内进行干热或湿热灭菌，则不必用纸包，金属筒有一圆筒形的带盖外筒，里面放一装培养皿的带底框架（图3），此5图5LDZX-50KBS灭菌锅图6LDZX-50KBS灭菌锅及控制面板框架可自圆筒内提出，以便装取培养皿。2.移液管的包装准备好干燥的移液管，在距其粗头顶端约0.5cm处，塞约1.5cm长的棉花，以免使用时将杂菌吹入其中，或不慎将微生物吸出管外。棉花要松紧适当（过紧，吹吸液体太费力；过松，吹气时棉花会下滑），接着按图4方法包扎，后将移液管集中在一起，用一张大报纸包好，进行干热或湿热灭菌。图4移液管的包扎方法与步骤3.试管和三角瓶的包扎试管管口和三角瓶瓶口塞上棉花塞或硅胶塞后，再用双层报纸包扎好（如有牛皮纸，效果更好），进行干热或湿热灭菌。试管较多时，一般7个或10个一组，再用双层报纸包扎。四、灭菌及净化设备操作技术（一）高压灭菌锅的使用利用高压水蒸汽高强度穿透细胞杀灭一切微生物及细胞。主要灭菌原理是高温度水蒸气（一般为121℃）作用于细胞一定时间（一般为20-30分钟）使细胞蛋白质凝固变性，而造成一切微生物变性死亡，是最为彻底的灭菌方法之一。主要操作技术见教材及实验操作步骤部分。（二）超净工作台的使用1）依次打开电源开关及工作开关，紫外灯照射20min，开启鼓风机运转10min，方可进行实验操作。2）将紫外灯切换到照明灯（鼓风机保持运转），打开玻璃门（玻璃门开启幅度不能过高，以不超过下巴为宜），手臂进入操作台前先点燃酒精灯，再用75%的酒精棉球擦净工作6图7摆斜面图9电热干燥箱外观和结构图8微孔滤膜过滤器装置构面，并对手进行消毒。3）操作时，应在工作台中央无菌区域进行（尽量不要讲话）。4）操作完毕后熄灭酒精灯，清理工作台。离开前，关闭工作台工作开关及电源开关，将所有物品归位，并带走废弃物。（三）其他常用灭菌工具五、实验具体操作步骤1.器皿清洗：将试管、三角瓶、培养皿等玻璃器具清洗干净；2.烘干：将经清洗干净的试管、三角瓶、培养皿等玻璃器皿放入烘箱中，并相互之间保持适当间距，以保证烘干效果；打开烘箱电源，设置适当温度（可根据具体情况而定）与时间，进行烘干处理；3.制作棉塞：按照选取棉花、棉花整理、折角、卷紧、成形、试塞、调整大小等步骤，制作合适棉塞，应使棉塞长度的1/3在试管口外，2/3在试管（或三角瓶）口内。另用量筒或吸管取适量自来水于三角瓶和试管中，包扎好以制备无菌水。4.包扎：用牛皮纸或旧报纸，一次包扎7～10套培养皿，按照裁剪牛皮纸、放置培养皿等玻璃器皿、卷紧、折边、包扎等步骤，包扎好后空培养皿、移液管等，做到美观大方、放置不到、包扎紧密，严防玻璃器皿等露出。5.灭菌处理：1）打开电源与开关，检查水位显示灯，视水位显示灯状况，不加或添加适量水（高水位：不必加水；低水位：视情况而定；缺水：必加水；无显示：视情况而定）。2）加灭菌物品（注意：物品不能过于密集，否则会影响灭菌效果）。3）将锅盖旋到灭菌锅正上方密封处（注意：锅盖用手提着缓慢旋至正上方，不要触及密封圈，造成密封圈破损，也不要将锅盖旋得太高，否则锅盖无法归位至正上方）。4）按待灭菌物品的要求，设定温度和时间。5）进入工作状态后，查看排气（水）阀，将阀门旋至排气处。6）待有大量白色蒸汽产生时，关闭排气阀，关闭后温度持续上升（注意：在使用高压7蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要）。7）灭菌结束，压力降至“0”时，打开排气阀，气体排尽后，方可开盖，利用锅内温度烤干棉塞和纱布后再取物。（注意：压力一定要降到0时，才能打开排气阀，开盖取物，否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者）。3、其他常见灭菌方式【实验结果】记录自己制作的实验用品（含无菌水）的名称、规格与数量。【注意事项】1.实验前，熟悉实验室布局，了解实验仪器用品摆放规律及用途；2.制备无菌水时，试管装水量一般控制在试管高度的1/5~3/5，三角瓶装水量不宜超过规格容量的1/2（装量过多，灭菌过程中易喷出或润湿棉塞）；3.灭菌锅的操作安全。【实验思考题】1.高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？2.灭菌完毕后，为什么待压力降低至“0”时，才能打开排气阀，开盖取物？3.在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素？4.灭菌在微生物实验操作中有何重要意义？8实验二培养基的配制【目的要求】1.掌握培养基的配制原理；2.通过对几种培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。【基本原理】培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素和水。本实验通过配制适用于一般细菌、放线菌和真菌的三种培养基来了解和掌握配制培养基的基本原理和方法。培养细菌一般用牛肉膏蛋白胨培养基，它是一种应用十分广泛的天然培养基，其中的牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl则提供无机盐。高氏Ⅰ号培养基是用来培养和观察放线菌形态特征的合成培养基，此合成培养基含有多种化学成分已知的无机盐，这些无机盐可能相互作用而产生沉淀，因此，在混合各成分时，一般按配方要求的顺序依次溶解各成分；此外，合成培养基有的还要补充微量元素，如高氏Ⅰ号培养基中的FeSO4·7H2O的用量仅为0.001%，在制备培养基时需预先配成高浓度的微量元素贮备液，然后再按一定的量加到培养基中。查氏培养基是用来分离和培养霉菌的合成培养基；麦氏培养基是用来分离和培养酵母菌的半合成培养基。培养基各成分添加完成后，用稀酸或稀碱将其pH值调至所需酸碱度，在配制固体培养基时，还要加入一定量的琼脂作为凝固剂。培养基配制完成后，应立即进行灭菌。【实验用品】1.药品、试剂牛肉膏，蛋白胨，NaCl，可溶性淀粉，KNO3，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，蔗糖，NaNO3，KCl，葡萄糖，KCl，酵母膏，醋酸钠，lmol/LNaOH，lmol/LHCl，琼脂2.仪器及其它用品试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，天平，牛角匙，pH试纸，棉花，牛皮纸，记号笔，线绳，纱布，漏斗，漏斗架，胶管等【方法步骤】一、牛肉膏蛋白胨培养基的配制（一）配方：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaC15g，琼脂15~20g，水1000mL，pH7.4~7.6；（二）步骤：1.称量按配方计算实际用量后，称取各种药品放