干扰RNA的应用

RNA干扰技术的应用一RNAi在基因组功能研究中的应用•随着人类基因组计划的提前完成,科学家急需一种新的、快速的方法解读基因的功能和基因的表达机制以及基因之间的相互关系。而RNAi技术已成为解决这些问题的重要手段。RNA干涉具有很高的特异性，只特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA。即使发生一个碱基的错配，RNAi作用的效应也会大大降低。RNA干涉抑制基因表达的效率很高，细胞仅需几个分子的小干扰RNA(smallinterferenceRNA,siRNA)，即可产生类似于缺失突变体表型的RNAi效应。RNA干涉抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持。与其他方法相比,RNAi技术在基因功能研究上有其独特的优点：技术的诸多优点使它很快便被作为研究基因功能的主要方法,如Harbth等应用RNAi技术发现有13个基因对哺乳动物培养细胞的生长和分化必不可少。Maeda等利用高通量RNAi技术对线虫的大约10000多个基因进行了功能分析,取得了理想的效果。总之,随着后基因组学时代的到来,RNAi技术将会成为功能基因组学研究的主要方法。二基因治疗1RNAi用于抗肿瘤治疗•肿瘤的发生是一种多基因协同作用的结果，利用RNAi技术可同时阻断多个癌基因的转录表达，从而有效抑制肿瘤的生长，达到治疗肿瘤的目的。•大量实验研究表明，利用RNAi技术特异的抑制癌基因、癌相关基因或者突变基因的过度表达，使这些基因保持在静寂或者休眠状态，从而有望达到抗肿瘤作用。•癌基因的激活认为是肿瘤发生的根本原因之一，多种癌基因可以作为靶点设计相对应的siRNA。利用基因家族中多个基因具有同一段同源性很高的保守序列这一特性，针对这一区段序列设计相应的siRNA，通过体外合成或构建在体内表达siRNA的载体的方法，转入细胞中，可以特异性的封闭这些基因的转录产物。2HIV•RNAi最早应用在研究siRNA体外抑制HIV感染上,使病毒复制大大减少。CCR5是内源性人受体蛋白,是主要的HIV-1共同受体,联合使用沉默宿主细胞CCR5受体基因和针对病毒结构基因的siRNA,能完全遏止病毒对细胞的感染。用siRNA转染外周血T细胞,CCR5表达量减少,从而使感染细胞数显著减少。•Lau等针对HIV-1整合宿主细胞基因组所必需的整合酶成功设计出shRNA转染细胞，数据显示能够有效抑制整合蛋白合成,并显著减少HIV-1病毒颗粒释放。3丙型肝炎•研究人员用电穿孔技术转染细胞发现,siRNA能消除丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)复制,可以基本“治愈”98%丙型肝炎患者的肝细胞。•Volarevic等就siRNA在细胞内对HCV的切割活性进行了系统论述。siRNA用来对抗HCVNS5B亦有效。Kapadia等先用反转录PCR筛选针对NS5B的siRNA,将能抑制HCVRNA的两种siRNA分别与表达HCV的质粒共转染Huh7细胞,杂交结果显示抑制程度分别达5.7和8.3倍。Suzuki等则进一步显示,在组织培养中siRNA对HCV有非常明显的抑制作用。因此,RNAi技术为HCV感染的治疗提供了一个新途径。4遗传性疾病的治疗美国西北大学的CarthewRW和日本基因研究所的IshizukaA等人发现RNAi同脆性Ｘ染色体综合征之间的关系密切，揭示了与RNAi相关机制的缺陷可能导致人类疾病的病理机制。遗传性疾病的RNAi治疗成为当今研究RNAi的又一大热点。三信号转导通路研究•由于RNAi能高效特异的阻断基因的表达，它成为研究信号传导通路的良好工具。•联合利用传统的缺失突变技术，RNAi技术可以很容易地确定复杂的信号传导途径中不同基因的上下游关系，Clemens等应用RNAi研究了果蝇细胞系中胰岛素信息传导途径，取得了与已知胰岛素信息传导通路完全一致的结果，在此基础上分析了DSH3PX1（Docksrchomology3phox1）与DACK（DrosophilaactivatedCdc42tyrosinekinase）之间的关系，证实了DACK是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶。•促分裂原激活蛋白激酶磷酸化酶1(MKP21)属于促分裂原激活蛋白激酶家族(MAPK),能够负调控促分裂原激活蛋白激酶信号传导。Jun等利用RNAi降低MKP21的表达,结果发现细胞内的P38和JNK的磷酸化得到加强,P38和JNK的磷酸化导致了细胞对H2O2的敏感,最终导致凋亡,搞清了MKP21表达对促进细胞对毒性H2O2抵抗的机制。四新药物的研究和开发•RNAi还可以作为寻找新的药物靶标的工具，可以高通量地发现药物靶基因，帮助新药物的研究和开发，了解药物作用的生化模式等。•Makimura等利用RNAi技术减少了丘脑下部AGRP（agouti-reletedpeptide）50%的表达量，AGRP使代谢率提高而不减少摄食量，从而减轻肥胖，为肥胖的治疗提供了一个靶点。美国Genetica公司已将RNAi技术作为高通量药物靶标识别和确认的工具。五RNAi转基因动物研究•通过转基因技术研究RNAi转基因动物，从而在全身组织细胞中抑制靶基因表达。是RNAi技术的一个重要应用。其中应用最广的是小鼠转基因模型。•RNAi技术不仅可以在整体水平上实现瞬时的RNAi效应，而且可以在转基因动物体内实现长期地、稳定的RNAi效应。六其它应用RNAi还可用于细胞周期调控、代谢、膜转运以及DNA损伤反应、转录或甲基化等多种方面的基因功能研究。最新研究发现，用RNAi技术阻断Ｎrdp1、BRUCE、Chk1、Wee1和Myt1等进一步解释了细胞凋亡的机制，其中BRUCE通常可抑制凋亡，而Ｎrdp1在凋亡初始阶段起到特别重要的作用。