循环肿瘤细胞技术进展

上海宝藤生物医药科技有限公司上海张江转化医学研发中心1869年AustMedJ，Ashworth最早在转移性癌症患者血液中观察到。2005年NEnglJMed，Cristofanilli证实治疗前CTC数目是转移性乳腺癌患者无进展生存期和总生存期的独立预测因子。循环肿瘤细胞指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。循环肿瘤细胞原发肿瘤血管生成侵润侵入血管内侵入血管外(CTC)血管内增殖(CTM)转移转移播散肿瘤细胞（DTC）微转移休眠灶循环肿瘤细胞（CTC）循环肿瘤微栓（CTM）凋亡的CTC侵润肿瘤细胞扩增血管生成上皮－间质转化（EMT）间质－上皮转化（MET）转移到骨髓和其他器官CTC能在哪些方面给我们思考和启示？CTC肿瘤转移机理预后评估复发预测疗效监控肿瘤分期耐药机制研究个体化治疗获取CTC需要解决的技术问题从红细胞和白细胞中富集恶性肿瘤细胞将恶性肿瘤细胞与红细胞、白细胞、正常上皮细胞、造血干细胞等区分开来每10mL血液中可能仅含有几个到几十个循环肿瘤细胞，而10mL血液中含有的白细胞约有1亿个，红细胞有500亿个。三种技术过滤法ISET:IsolationbySizeofEpithelialTumorcells8μm孔径过滤膜，漏检体积较小的肿瘤细胞敏感性低梯度密度法肿瘤细胞和单核细胞密度小于1.077g/mlCTC纯度低，混入较多白细胞肿瘤细胞会迁移至血浆层，而聚集后容易下沉聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)对细胞有毒性免疫磁珠法•肿瘤细胞表面抗原EpCAM与包绕着磁珠的特异性单抗相结合•CellSearch细胞保存方法长达96小时•实验室室间差异小•EpCAM的假阳性和假阴性CellSearch---免疫磁珠+流式细胞分析+化学发光90年代中期开始摸索捕获、分析CTC的方法1999-2003大量临床实验建立CellSearch与CTC的临床相关数据2004获得美国FDA批准用于临床2009ClevelandClinic十大医学突破第一名2009PrixGalienUSA最佳医学技术奖2010.1中国CTC在复发转移乳腺癌上的应用注册实验2011.5CTC在小细胞肺癌上的应用实验研究……%ProbabilityofSurvivalTimefromBaseline(Months)02468101214161822242628300%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%20Logrankp0.000121.9Months10.9Months5CTCsn=87(49%)5CTCsn=90(51%)CellSearch是全球第一也是唯一经FDA批准可用于临床的循环肿瘤细胞（CTC）产品1983磁流体CellSearch免疫磁珠原理白细胞Anti-CD45CD45NucleusDAPI如何鉴别出CTC?藻红蛋白(PE)变藻蓝蛋白(APC)CTCAnti-EpCAM磁珠Anti-CK-PENucleusDAPICKEpCAM在CellSearch®检测中，CTC被设定为：EpCamCK-8,18和/或19DAPICD45+++-CellSave储存管CellSearchCTC检测试剂盒CellSearch:自动化的CTC分离、富集和计数CellTracksAutoPrep系统磁巢MagnestCellTracksAnalyzerII96小时稳定2004年FDA批准CTC质控试剂盒磁力捕获CellSearch技术的可重复性和高敏感度CellSearch系统是CTC检测目前唯一的自动化、标准化平台减少方法学及人工操作引起的结果差异实验结果的可重复性实验室间结果的可比性系统线性系数：R=0.990，线性范围0-1238系统最低检测限度：7.5ml外周血中的1个肿瘤细胞转移性乳腺癌患者治疗前CTC水平是有效的预后预测因子。CTC计数小于5的患者无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）均显著高于CTC计数大于等于5的患者。无进展生存期总生存期CTC在乳腺癌中对预后的预测IF:53.484NEnglJMed.2004Aug19;351(8):781-91.Circulatingtumorcells,diseaseprogression,andsurvivalinmetastaticbreastcancerJClinOncol.2005Mar1;23(7):1420-30.Circulatingtumorcells:anovelprognosticfactorfornewlydiagnosedmetastaticbreastcancer.CTC在治疗前后都是强烈而独立的预后因子。在基线位置检测CTC对于PFS和OS有较高预测意义。CTCsbeforeandaftertheinitiationoftherapywerestrong,independentprognosticfactors.DetectionofCTCsbeforeinitiationoffirst-linetherapyinpatientswithMBCishighlypredictiveofPFSandOS.一线化疗前，即基线一线化疗一个疗程后，即3～4周后IF:18.970ClinCancerRes.2006Jul15;12(14Pt1):4218-24.Circulatingtumorcellsateachfollow-uptimepointduringtherapyofmetastaticbreastcancerpatientspredictprogression-freeandoverallsurvival.CTC在治疗的任何时段升高都预示乳腺癌病情进展，预后不良。DetectionofelevatedCTCsatanytimeduringtherapyisanaccurateindicationofsubsequentrapiddiseaseprogressionandmortalityforMBCpatients.IF:7.338CTCs与影像相比I:更早、更具重现性、与OS的相关性更强！RadiologicAssessmentat12weeksCTCAssessmentat4.5weeksCTCAssessmentat10-12weeks(withintwoweeksofimaging)CTCAssessmentat8weeks(within4weeksofimaging)ClinCancerRes.2006Nov1;12(21):6403-9.Circulatingtumorcellsversusimaging--predictingoverallsurvivalinmetastaticbreastcancer.IF:7.338JClinOncol.2009Jul10;27(20):3303-11.Circulatingtumorcellsand[18F]fluorodeoxyglucosepositronemissiontomography/computedtomographyforoutcomepredictioninmetastaticbreastcancer.在转移性乳腺癌中，CTC检测达到5个或更多对于MBC的治疗监控优于FDG-PET/CT检查。当CTC计数低于5个时，FDG-PET/CT具有一定预后价值。DetectionoffiveormoreCTCsduringtherapeuticmonitoringcanaccuratelypredictprognosisinMBCbeyondmetabolicresponse.FDG-PET/CTdeservesaroleinpatientswhohavefewerthanfiveCTCsatmidtherapy.CTC与FDG-PET/CT对于乳腺癌治疗监控的对比：IF:18.970AnnOncol.2010Jan;21(1):33-9.Epub2009Jul14.CirculatingtumorcellsandbonemetastasesasdetectedbyFDG-PET/CTinpatientswithmetastaticbreastcancer.无骨转移只有骨转移有多处器官转移3.在多处累及患者中，CTC计数仍是预后的独立判断因子1.CTC计数≥21，96%有骨转移，且全部为多处骨转移2.CTC计数越高，越与多处骨转移或多器官转移相关IF:6.452FISH分析(A)白细胞有两份CEP7（绿色），EGFR（红色）和MET(蓝色)(B)CTC中，EGFR（红色）和MET(蓝色)基因扩增BrJCancer.2010May11;102(10):1495-502.ImprovingtheyieldofcirculatingtumourcellsfacilitatesmolecularcharacterisationandrecognitionofdiscordantHER2amplificationinbreastcancer.IF:4.831HER2+：使用FISH方法，HER2/CEP17≥2.09/10转移灶为HER2-原发灶肿瘤其转移灶为HER2+患者总数CTC中HER2-的患者数量CTC中HER2+的患者数量不一致比率2004NEnglJMedCTC升高，PFS和OS均降低，CTC是预后的独立预测因子2005JClinOncolCTC在治疗前后都是预后的强烈而独立预测因子2006ClinCancerResCTC在治疗的任何时段升高都预示乳腺癌病情进展，预后不良2006ClinCancerResCTC计数对于乳腺癌病情状态判断要比当前的影像学方法更早且更具有可重复性2008AnnOncol治疗中CTC的变化提示疾病对于治疗的反应2009JClinOncolCTC检测达到5个或更多对于MBC的治疗监控优于FDG-PET/CT检查2010AnnOncolCTC计数越高，越与多处骨转移或多器官转移相关CTC在乳腺癌中的研究结果回顾JClinOncol.2008Jul1;26(19):3213-21.Relationshipofcirculatingtumorcellstotumorresponse,progression-freesurvival,andoverallsurvivalinpatientswithmetastaticcolorectalcancer.在影像学检查无进展患者中，1个月内检查CTC小于3的组别的生存期比大于等于3的组别更长(18.8个月vs7.1个月；P0.0001)。Amongnonprogressingpatients,favorablecomparedwithunfavorableCTCswithin1monthofimagingwasassociatedwithlongersurvival(18.8v7.1months;P0.0001).IF:18.970AnnOncol.2009Jul;20(7):1223-9.Epub2009Mar12.Prognosticsignificanceofcirculatingtumorcellsinpatientswithmetastaticcolorectalcancer.总患者数量（N=430）特征奥沙利铂伊立替康贝伐单抗所有病人一线治疗二三线治疗肝转移65岁以上65岁以下基线CTC计数/7.5ml≥3个基线抽血后无进展生存期中位数（月）＜3个≥3个基线抽血后总体生存期中位数（月）＜3个≥3个不论病人的治疗方案和病人体质特性，基线CTC计数均是重要的预后因子。BaselineCTCcountisanimportantprognosticfactorwithinspecificsubgroupsdefinedbytreatmentorpatientcharacteristics.IF:6.452AnnOncol.2