分枝杆菌实验室的标准化操作

分枝杆菌实验室的标准化操作直接涂片法步骤竹签茬端，取痰标本中干酪样或脓样部分，玻片右2/3处，均匀涂抹10x20毫米的椭圆形痰膜不可在火焰上加热时涂片！！不得以火焰加热加速痰膜干燥太厚适宜太薄痰膜的厚薄染色（1）•玻片放在染色架上，玻片间距保持10毫米以上的距离，染色架下空间足够，方便加热•火焰固定（5秒钟将玻片过火4次）•滴加石炭酸复红染液，盖满玻片。•加热至出现蒸汽，勿使沸腾。脱离火焰，保持5分钟。•高海拔地区（西藏、青海）：定期过滤染色液；如室温低则用前热水浴加热染液；火焰加热，由于海拔高、沸点低，需加热多次染色(2)脱色：轻缓冲洗沥水。滴加脱色液，保持1分钟。如不彻底，重复。特别说明：脱色时出现油状物时，可能复染滴加亚甲蓝复染液，保持30秒钟流水冲洗，沥去玻片上的水。玻片干燥后镜检滴加镜油1.接通电源，打开开关上升聚光镜至最高，调节光圈70－80％大小2.将涂片放在载物台上，痰膜朝上显微镜检查•读片时，首先从左至右观察；•纵向向下转换一个视野；•然后从右向左观察结果报告阴性未发现抗酸菌/300视野报告实际菌落数1-8条/300视野(1+)1-9条/100视野(2+)1-9条/l0视野(3+)1-9条/每视野(4+)达到或超过10条/每视野分枝杆菌培养•培养基质控•前处理•接种和孵育•结果和报告原理：分枝杆菌对酸碱有相对强的耐受力。目的：液化标本、去除杂菌、分离出分枝杆菌原则：-尽可能杀灭标本中的杂菌-尽可能保存标本中的分枝杆菌标本前处理前处理的步骤：取1－2ml痰标本至前处理管视标本性状加入1－2倍体积的4％氢氧化钠震荡30－60秒至标本完全液化室温静置15分钟（整个处理时间不得超过20分钟）操作痰标本1－2倍4%NaOH振荡匀化静置15分钟前处理的注意事项：标本留取后4℃保存、尽快处理选择标本中脓性、血样、干酪样的部分进行培养避免弱处理和过处理-前处理液的浓度-处理时间避免交叉污染－－－先阴性、再低涂阳、后高涂阳吸取标本、加液、涡旋震荡时可能产生危险气溶胶37℃竖直培养8周均匀接种0.1ml,2支/标本斜面向上，37℃水平放置24小时接种和孵育接种的注意事项：培养基斜面的背面标注（标本号、姓名、接种日期）标本应尽可能布满斜面避免污染：-使用灭菌的移液管-无菌手法操作-接种后避免液体流至瓶口、瓶盖接种量：0.1毫升（2滴）可能产生危险气溶胶孵育的注意事项：接种后斜面向上孵育24小时之后培养基直立继续孵（检查瓶盖是否拧紧）温度监测光线的影响－避免使用可视窗的温箱•接种后第3、7天各观察一次菌落生长情况•此后每周观察一次，直至满8周•每次观察记录菌落生长及污染情况四、结果的观察与报告满8周后未见菌落生长，可报告分枝杆菌生长阴性，培养管高压后丢弃；发现显著污染以至无法观察结果，记录“污染”，培养管高压后丢弃；发现疑似分枝杆菌生长，将培养管冷藏保存，报告省参比实验室，待其收取。报告方式分枝杆菌培养阴性：斜面无菌落生长分枝杆菌培养阳性（1+）：菌落生长占斜面面积的1/4分枝杆菌培养阳性（2+）：菌落生长占斜面面积的1/2分枝杆菌培养阳性（3+）：菌落生长占斜面面积的3/4分枝杆菌培养阳性（4+）：菌落生长布满整个斜面菌落生长不足斜面面积1/4者，报实际菌落数。结果报告的注意事项：必须记录生长过程,不得只记录最终结果不得打开培养管进行操作发现可疑分枝杆菌生长时尽快送药敏试验室阴性培养管也要高压后丢弃培养的质量控制：培训和预培养人员、房间、设备固定培养基统一提供结核分枝杆菌的生长要求：•专性需氧菌•最适PH为6.5～7.2•温箱设定温度为36℃,温度范围35－37小结–操作流程涡旋振荡1分钟痰标本中加入1-2倍体积4%NaOH分别接种0.1ml前处理液至2只培养基斜面第3天、7天、此后每周观察一次直至第九周,记录菌落生长和污染置36C温箱培养室温静置15分钟432561