4酶分子化学修饰2

第四章酶分子的修饰第二节酶化学修饰的种类及应用一、酶的表面化学修饰（一）大分子修饰（大分子结合修饰）是目前应用最广的酶分子修饰方法。1.定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。2.修饰剂：聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下与酶分子共价结合。3.应用：如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD）PEG－溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等）PEG－天门冬酰胺酶（ASNase）•消除了抗原性•延长了酶在体内的半衰期又如：用Dextran右旋糖酐修饰-淀粉酶，－淀粉酶，胰蛋白酶、过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。（二）小分子修饰（酶蛋白侧链基团修饰）1概念•定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应。•侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。•侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。根据氨基酸侧链R基的极性，20种氨基酸可分成4类。①非极性R基氨基酸（共8种）：丙氨酸(Alanine,Ala,A),亮氨酸(Leucine,Leu,L),缬氨酸(Valine,Val,V)),异亮氨酸(Isoleucine,Ile,I),苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F),色氨酸(Tryptophan,Trp,W),甲硫氨酸(Methionine,Met,M),脯氨酸(Proline,Pro,P)②无电荷的极性R基氨基酸（共7种）：丝氨酸(Serine,Ser,S),苏氨酸(Threonine,Thr,T),酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y),半胱氨酸(Cysteine,Cys,C),天冬酰胺(Asparagine,Asn,N),甘氨酸(Glycine,Gly,G),谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q)③带正电荷的极性R基氨基酸（共3种）：赖氨酸(Lysine,Lys,K),精氨酸(Arginine,Arg,R),组氨酸(Histidine,His,H)④带负电荷的极性R基氨基酸（共2种）：天冬氨酸(Asparticacid,Asp,D),谷氨酸(Glutamicacid,Glu,E)•小分子修饰的几种重要反应：烷基化反应酰化反应氧化还原反应芳香环取代反应2修饰反应1)烷基化反应试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基团（如－NH2，-SH等）发生烷基化。可作用基团：氨基（Lys赖，Arg精），巯基（Cys半光），羧基（Asp天冬、Glu谷），甲硫基（Met甲硫），咪唑基（His组）。修饰剂：2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。烷基化反应2)酰基化反应试剂特点：含有结构，作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化。可作用基团：氨基，巯基，醇羟基（Ser丝、Thr苏），酚羟基（Tyr络）酰基化反应3)氧化还原反应试剂特点：具有氧化或还原性。氧化剂：H2O2，N-溴代琥珀酰亚胺可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑基，酚基等。还原剂：2－巯基乙醇、DTT等。可被还原的侧链基团：二硫键。连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。4)芳香环取代反应试剂：卤（碘）化，硝化试剂。碘代：I2＋+HI硝化：(NO2)4C++(NO2)3CH（四硝基甲烷）3特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰1)氨基的化学修饰：来源：Lys赖,Arg精,His组,Gln谷修饰反应：酰基化与烷基化酰基化修饰剂:三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）烷基化修饰剂：2，4－二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸等2，4－二硝基氟苯碘乙酸三硝基苯磺酸2)羧基的化学修饰修饰羧基的反应专一性较差。常用水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸。可定量测定酶分子中羧基的数目。+水溶性碳化二亚胺3)胍基的化学修饰来源：Arg精修饰反应：本质上是羰Tang=co基对氨基酰基化。修饰剂：丁二酮二羰基化合物1，2－环己二酮苯乙二醛4)巯基的化学修饰来源：Cys半光修饰反应:烷基化修饰剂：碘乙酸(IAA)碘乙酰胺(IAM)E-SH+R-X－E-SR+HXN-乙基马来酰亚胺（NEM）（常用的专一修饰巯基试剂）E－SH＋5)二硫键的化学修饰还原：巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）氧化：过甲酸:6)咪唑基的化学修饰来源：His组修饰反应:酰基化与烷基化酰基化修饰剂:常用焦碳酸二乙酯（diethylparacarbonate）++C2H5OH+CO2烷基化修饰剂：碘乙酸7）酚羟基的化学修饰来源：Tyr酪修饰反应：芳香环取代反应修饰剂：碘、硝化试剂（四硝基甲烷）8）吲哚基的化学修饰来源：Trp色修饰反应：氧化反应修饰剂：N-溴代琥珀酰亚胺氨基酸侧链基团修饰剂Lys氨基三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸Asp、Glu羧基水溶性碳化二亚胺Arg胍基苯乙二醛，1,2－环己二酮、丁二酮Cys巯基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺二硫键巯基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羟基碘、四硝基甲烷Trp吲哚基N-溴代琥珀酰亚胺各种氨基酸侧链的修饰剂但解释修饰效果须十分小心，因为：①任何一种修饰剂不是绝对专一的。②有些修饰剂引起蛋白质构象变化——失活，不一定是活性中心基团被共价修饰。③不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子内部的必需基团，不易被修饰。（三）交联修饰（交联法）用双功能基团试剂(如戊二醛)，与酶分子内不同肽链部分共价交联，使酶分子空间构象更加稳定。（四）固定化修饰（共价偶联法）通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接到惰性载体上，由于酶所处的微环境发生改变，使酶的最适pH、最适温度和稳定性发生改变。二、酶分子内部修饰（一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）蛋白主链修饰采用酶法（用专一性较强的蛋白酶或肽酶为修饰剂）。（与前面化学修饰区别）酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：1引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。2仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。3有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行，称肽链有限水解。应用实例：1）提高酶活力：2）消除抗原性：（二）氨基酸置换修饰将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法。通过两个途径实现：化学修饰法：由于可用试剂的限制，获得的种类少。蛋白质工程：利用基因操纵技术。（三）金属离子置换修饰改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法。思考题：酶化学修饰的种类有哪些?