第四章 抗体多样性的产生

第六节Ig的基因结构与Ab多样性的产生一、抗体学说的发展二、Ig的基因结构三、Ig基因重排和表达四、抗体多样性的产生机制•根据抗原抗体反应的特异性，针对于某一种特定抗原，就会有特异的抗体与之相对应。也就是说，外界存在有多少种抗原，在体内就会产生相应的抗体。据估计，在人体内具有产生超过1亿种抗体的潜在能力。•如此多的抗体类型是如何产生的呢？Ab多样性和特异性是如何产生的？抗体是如何产生的？•预先储备抗原特异性•抗原诱导抗体特异性抗体多样性的产生？•一个基因编码一个蛋白•一个基因编码多个蛋白上帝之谜：GOD（GenerationofDiversity）一、抗体学说的发展•侧链学说•抗原诱导学说直接模板学说折叠学说间接模板学说•选择学说自然选择学说克隆选择学说一、抗体学说的发展抗体形成机制的研究：侧链学说（1897年，Ehrlich）•细胞具有多种膜侧链，毒素可以特异与相应侧链结合•细胞可产生多量而过剩的侧链，并将其释放的血液中，即成为抗体，这种游离的抗体，在血液中与毒素结合，便可将其中和，从而达到免疫效果。•一个细胞克隆具备针对多种抗原的多种膜侧链一、抗体学说的发展直接模板学说：抗原为模板合成抗体（1930年，Breinl和Haurowits）–前提：蛋白质的合成要以蛋白质为模板。–抗体的产生必需以抗原为模板，抗体的抗原结合部位是以抗原决定簇为模板而形成的。折叠学说：抗原诱导抗体折叠（1940年，Pauling）–所有抗体的初级结构完全相同，即氨基酸的排列顺序，其决定于基因。–球蛋白的高级结构取决于多肽链的折叠方式，高级结构决定抗体的特异性。–如在形成球蛋白处附着有抗原时，即球蛋白的高级结构即按抗原折叠，因而可使抗体获得特异性。一、抗体学说的发展间接模板学说：抗原对基因发生影响（1949年，Burnet和Fenner）–抗原进入细胞核中，干扰DNA的合成，指导抗体的特异性。–抗原在细胞内继续存在，而且可随细胞而增殖，所以抗原不存在也能产生抗体。–对于自身与非自身的识别上，认为一切属于自身的物质，均有自身的标记（self-marker），识别单位可以对其加以识别，因此对自身物质不能发生免疫反应。一、抗体学说的发展自然选择学说（1955年，Jerne）–机体对任何抗原早已准备下了相似的抗体（自然抗体），外来的抗原如与某种自然抗体相对应时，便可与之结合。–抗原抗体复合物被巨噬细胞吞噬后，抗原被酶溶解，剩下的抗体便可在巨噬细胞内诱导产生与其具有同样特异性的抗体。–在抗体的形成上，起主要作用的是体内早已存在的抗体。这种抗体在特异性抗原的选择作用下，才能诱导吞噬细胞产生抗体。一、抗体学说的发展克隆选择学说（Cloneselectivetheory）受到Jerne的自然选择学说的影响，澳大利亚免疫学家Burnet毅然放弃其间接模板学说，并且引进了他在间接模板学说所主张的基因致使细胞特异性的概念1957年发表了以“AmodificationofJernetheoryofantibodyproductionusingtheconceptofcloneselection”为题的论文。1959年出版了题为《Theclonalselectiontheoryofaquiredimmunity》的专著，创立了举世闻名的克隆选择学说。一、抗体学说的发展克隆选择学说（Cloneselectivetheory）基本思想动物体内存在大量的淋巴细胞克隆，每一克隆表面都带有特异性的SIg。抗原选择的不是游离的抗体，而是事先存在于淋巴细胞膜表面的抗原受体，即表面免疫球蛋白（SIg）。抗原能够选择性的激活带有相应受体的淋巴细胞克隆，使其分化增殖，产生相应抗体。决定抗体结构的是淋巴细胞的基因，抗原不能改变修饰产生抗体的基因。克隆选择学说（Cloneselectivetheory）对抗体产生多样性的解释：动物出生后，体内约有107个免疫细胞克隆，能产生各种抗体，足够抗原选择。抗原与特异淋巴细胞的抗原受体结合，相应的克隆即被选择，进而增殖分化，产生抗体。抗原的作用：抗原的作用只是启动，与枪机的扳机相似。相应的克隆一旦被选出，即便没有抗原的存在，也能继续产生抗体。决定抗体特异性的是DNA，抗原对其无影响克隆选择学说（Cloneselectivetheory）对免疫记忆现象的解释：细胞克隆在分化过程中，一部分淋巴细胞停留在中间阶段，与再次同相应的抗体接触时，立刻发育成熟而产生抗体，呈现免疫记忆现象。对免疫耐受现象的解释：在胚胎后期，自身抗原已经齐备，于是凡能与自身抗原特异性结合的相应克隆，便可受到阻抑，最后被清除，构成自身免疫耐受。•取被卵白蛋白、牛血清蛋白免疫的A兔的淋巴细胞（能产生抗卵白蛋白、牛血清蛋白的抗体）•玻璃珠（附有牛血清蛋白）亲和淋巴细胞，收集非结合淋巴细胞。（玻璃珠附有牛血清白蛋白，同产生抗牛血清白蛋白的B细胞克隆发生结合而清除；抗卵白蛋白的淋巴细胞未被清除）•用X射线处理B兔子，破坏骨髓，杀死原有的淋巴细胞；注入经玻璃珠处理的A兔淋巴细胞•卵白蛋白、牛血清蛋白免疫B兔，只产生抗卵白蛋白的抗体克隆选择学说（Cloneselectivetheory）——实验证据1：Wigzell实验•A抗原偶联放射性元素，免疫动物，清除能与A抗原结合的淋巴细胞，不能分泌抗A抗体•识别其他抗原的细胞则不受影响，能产生抗体。克隆选择学说（Cloneselectivetheory）——实验证据2：Humphrey放射自杀实验A产生抗A及抗B抗体抗原A抗原BB产生抗B抗体不产生抗A抗体++结论一、抗体学说的发展抗体是如何产生的？•预先储备抗原特异性•一个B细胞克隆对应一种抗体抗体多样性的产生？•一个基因编码一个蛋白•一个基因编码多个蛋白未完待续面对自然界中无穷无尽的抗原，就要求机体必须产生无限多的相应的特异性抗体与之针锋相对，但怎样才能使机体内为数不多的基因产生如此多的抗体呢？二、Ig的基因结构以重链为重点二、Ig的基因结构1.H基因库（重链基因连锁群）第14号染色体2.κ基因库（κ链基因连锁群）第2号染色体3.λ基因库（λ链基因连锁群）第22号染色体（一）人类胚系Ig基因及其定位（二）人类胚系Ig基因结构二、Ig的基因结构H链：包括V、D、J、C基因片段。C基因片段的排列顺序是：5’-Cμ-Cδ-Cγ3-Cγ1-Cα1-Cγ2-Cγ4-Cε-Cα2-3’L(κ/λ)链：包括V、J、C基因片段。•重链V区的基因由V、D、J三个基因片段组成•轻链V区基因由V、J两个基因片段组成。H链的编码•V区：V、D、J基因编码–V基因：CDR1、CDR2–D基因及V-D：大部分CDR3–D-J基因：CDR3其余部分及骨架区•C区：C基因编码了解H链胚系基因结构C区基因（CH）:9个V区基因V基因片段（VH）:65个D基因片段（DH）:27个J基因片段（JH）:6个了解三、Ig基因重排和表达编码一条Ig重链、轻链的基因是由胚系中多个分开的DNA片段经剪切重排而成的。Ig基因表达的特点（一）Ig基因重排（二）等位排斥与同种型排斥（三）Ig的类别转换（四）分泌型和膜型Ig（五）mIgM与mIgD的共表达Ig基因重排：Ig胚系基因中，V、（D）、J基因片段之间由内含子隔开，通过基因片段的随机重排，形成V（D）J连接，再与Ｃ基因片段连接，才能编码完整的Ig多肽链。Ig基因重排主要通过重组酶（recombinase）的作用实现。Ig胚系基因重排程序首先是重链发生基因重排，随后是轻链重排。重链：胚系基因→D-J连接→V-DJ连接三、Ig基因重排和表达（一）Ig基因重排重点三、Ig基因重排和表达•等位排斥（allelicexclusion）：一条染色体上Ig重链基因的有效重排，抑制另一条同源染色体重链基因重排。B细胞中位于一对染色体上的轻链或重链基因，其中只有一条染色体上的基因得到表达。保证了一个B细胞只表达一种轻链和一种重链，也即只表达一种特异抗原受体。•同种型排斥（isotypeexclusion）：是指两种轻链之间的排斥，轻链有κ链和λ链，但一个Ig分子只能表达其中的一种，或是κ链，或是λ链。(注意：二者在非同源的染色体)三、Ig基因重排和表达（二）等位排斥与同种型排斥•类别转换（classswitching）：指B细胞在受抗原刺激后，首先合成IgM，然后转为合成IgG、IgA和IgE等的现象。由于Ig的类型由重链决定，所以在重链重排时，在V区基因不变的情况下，C基因发生重排，使得最终的基因产物的V区相同，而C区不同；也就是说抗体识别的特异性相同，但Ig分子的类型却发生了改变。三、Ig基因重排和表达（三）Ig的类别转换重点IgGIFN-γIL-4IgEIL-5IgA（三）Ig的类别转换（图解）cmcdcg3VJCg3DVJDV-D-JcmV-D-JCg3CmCdIgMIgGcmcdcg3VJDVJCg3DDNA初始RNAmRNADNA重排重排后DNA丢失的DNARNA选择剪切Ig的类别转换比较Ig基因重排与类别转换V区基因重排类别转换性质DNA初次重排DNA二次重排发生位点骨髓外周淋巴组织发生时间B细胞骨髓发育成熟抗原刺激作用抗原特异性的B细胞发育产生功能性抗体三、Ig基因重排和表达三、Ig基因重排和表达（四）分泌型和膜型Ig•IgM–膜型(mIgM)：作为B细胞受体接受抗原信息，活化B细胞–分泌型(SIgM)：结合抗原，发挥免疫防御作用产生机制：RNA选择剪切了解RNA选择剪切•幼稚B细胞的分化过程中，首先表达mIgM，后表达mIgD；mIgD是B细胞的重要表面标志。•B细胞若仅表达mIgM，在接受抗原刺激后易形成耐受性，若同时表达mIgM和mIgD，则受抗原刺激后可被激活。故mIgD可作为B细胞分化发育成熟的标志，活化的B细胞或记忆B细胞的mIgD逐渐消失。三、Ig基因重排和表达（五）mIgM与mIgD的共表达了解V-D-JdV-D-JmdPloyAPloyAV-D-JmIgDmRNAIgMmRNAPrimaryRNAtranscript三、Ig基因重排和表达了解产生机制：RNA选择剪切四、抗体多样性的产生机制破解上帝之谜•1965年Bennet首先提出“两个基因编码一条多肽链”假说，认为Ig的V区和C区是由分隔存在的基因所编码，在淋巴细胞发育过程中这两个基因发生易位而重排在一起。•1976年利根川进应用DNA重组技术证实了这一假说。发现：编码一条Ig多肽链的基因是由各个分隔开的DNA片段经剪接重排而形成。四、抗体多样性的产生机制利根川进因“发现抗体多样性的遗传学原理”而获1987年诺贝尔生理学或医学奖。实验证据1.编码Ig基因的多样性（原始因素）2.随机重排产生的多样性（主要因素）3.H、L链的随机组合四、抗体多样性的产生机制VH:40(V)×25(D)×6(J)=6000VL(k):40(V)×5(J)=200VL(l):30(V)×4(J)=1201.9×106抗体多样性机制4.不准确连接、核苷酸插入5.体细胞高频突变：B细胞在受到抗原剌激后，已重排好的V区基因(尤CDR3)突变频率增高，称体细胞高频突变。经过抗原的选择，使V区CDR(互补决定区)与抗原的亲和力得到优化，即为抗体的亲和力成熟。抗体多样性机制四、抗体多样性的产生机制+N-核苷酸+TdT重链基因的重排、RNA处理和蛋白质表达的过程HKLVDJ基因组合VDJVxDxJ501263600605300307210H/K(L)3600x(300+210)=1.6x106ImpreciseJoining多样性至少增加100倍NucleotideAddition多样性增加2000倍体细胞超突变突变频率是其它基因的百万倍以上。使抗体对抗原的亲和力增加100-1000倍。Ig(BCR)多样性可达1014，TCR多样性可达1016Question：为什么有的人打乙肝疫苗却没有诱导出抗乙肝抗体？第七节抗体的制备•多克隆抗体•单克隆抗体•基因工程抗体一、多克隆抗体（polyclonalan