细胞凋亡

2009.04.281细胞凋亡及其实验室检测cellapoptosislaboratorytest检验系郭旭霞2020/1/232死亡是生命的普遍现象，但细胞死亡并非与机体死亡同步。正常的组织中，经常发生“正常”的细胞死亡，它是维持组织机能和形态所必需的。细胞死亡的方式通常有2种：–①细胞坏死（necrosis）–②程序性细胞死亡（programmedcelldeath，PCD）。2020/1/2332002年10月7日英国人悉尼·布雷诺尔、美国人罗伯特·霍维茨和英国人约翰·苏尔斯顿，因在器官发育的遗传调控和细胞程序性死亡方面的研究，获诺贝尔生理与医学奖。2020/1/234细胞坏死与细胞凋亡细胞凋亡的调控细胞凋亡常用的检测方法细胞凋亡与疾病的关系2020/1/235一、细胞坏死与细胞凋亡cellnecrosisandcellapoptosis(一)细胞坏死cellnecrosis：–是细胞受到化学因素（如强酸、强碱、有毒物质）、物理因素（如热、辐射）和生物因素（如病原体）等环境因素的伤害，引起细胞死亡的现象。–坏死细胞的病理过程：酶性消化和蛋白变性。–参与此过程的酶，如来源于死亡细胞本身的溶酶体，则称为细胞自溶（autolysis）；若来源于浸润坏死组织内白细胞溶酶体，则为异溶（heterolysis）。2020/1/236细胞坏死的特征：–细胞坏死初期，胞质内线粒体和内质网肿胀、崩解，核发生固缩或断裂。随着胞质内蛋白变性、凝固或碎裂，以及嗜碱性核蛋白的降解，细胞质呈现强嗜酸性，故坏死组织或细胞在苏木精/伊红染色切片中，胞质呈均一的深伊红色，原有的微细结构消失。–最后细胞膜和细胞器破裂，各种细胞器溶解，细胞结构完全消失，DNA降解，细胞内容物流出，引起周围组织炎症反应。2020/1/237(二)细胞凋亡cellapoptosis细胞凋亡是细胞死亡的一种形式，是调控机体发育、维护内环境稳定，由基因控制的细胞的自主有序的死亡形式。细胞凋亡是借用古希腊语，表示细胞象秋天的树叶一样凋落的死亡方式。在细胞凋亡一词出现之前，胚胎学家已观察到动物发育过程中存在着程序性细胞死亡（programmedcelldeath，PCD）现象，它是胚胎正常发育所必需的。近年来PCD和细胞凋亡常被做为同义词使用，但两者实质上是有差异的。PCD是一个功能性概念，描述在一个多细胞生物体中，某些细胞的死亡是个体发育中一个预定的，并受到严格控制的正常组成部分，而凋亡是一个形态学概念，指细胞坏死受到基因控制的细胞死亡形式。2020/1/2381.细胞凋亡的生物学意义：①PCD在生物界普遍存在。②PCD是多细胞生物生命活动过程中不可缺少的组成内容，是其藉以存活的需要，贯穿于全部生命过程中，无论中低等还是高等生物都是如此。③PCD是生物在进化过程中形成的细胞死亡形式。2020/1/2392.凋亡细胞的主要特征：–①染色质聚集、分块、位于核膜上，胞质凝缩，最后核断裂，细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体；–②凋亡小体内有结构完整的细胞器，还有凝缩的染色体，可被邻近细胞吞噬消化，因始终有膜封闭，没有内溶物释放，故不会引起炎症；–③凋亡细胞中仍需要合成一些蛋白质，但是在坏死细胞中ATP和蛋白质合成受阻或终止；–④核酸内切酶活化，导致染色质DNA在核小体连接部位断裂，形成约200bp整数倍的核酸片段，凝胶电泳图谱呈梯状条带；2020/1/23102020/1/2311细胞凋亡和细胞坏死的区别区别点细胞凋亡细胞坏死起因生理或病理性病理性变化或剧烈损伤范围单个散在细胞大片组织或成群细胞细胞膜保持完整，一直到形成凋亡小体破损染色质凝聚在核膜下呈半月状呈絮状细胞器无明显变化肿胀、内质网崩解细胞体积固缩变小肿胀变大凋亡小体有，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬无，细胞自溶，残余碎片被巨噬细胞吞噬基因组DNA有控降解，电泳图谱呈梯状随机降解，电泳图谱呈涂抹状蛋白质合成有无调节过程受基因调控被动进行炎症反应无，不释放细胞内容物有，释放内容物2020/1/2312二、细胞凋亡的调控Apomoleculemechanism细胞凋亡是受基因调控的精确过程，通过细胞凋亡清除衰老和病变的细胞，保证了机体的健康。许多因素可诱导或抑制凋亡，如激素、细胞因子、抗体、超抗原、粘附分子、免疫细胞(NK)、化疗药物、致癌药、生长因子、高温、放射线等。2020/1/2313激活细胞凋亡的途径主要有两条，一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspase、一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase。这些活化的凋亡酶可将细胞内的重要蛋白降解，引起细胞凋亡。2020/1/2314(一)与Apo有关的基因和蛋白：1．Caspase家族–Caspase是个大家族，现发现的已有13个同源物，均属于半胱氨酸蛋白酶，也叫凋亡酶，这些蛋白酶是引起细胞凋亡的关键酶，一旦被信号途径激活，将启动caspases级联反应，将细胞内的蛋白质降解，使细胞不可逆的走向死亡。2020/1/23152．Fas/APO-1–Fas/APO-1又称作APO-1/CD95，属TNF受体家族。Fas蛋白与Fas配体结合后，会激活caspase，导致靶细胞走向凋亡。3．p53–是一种抑癌基因，其生物学功能是在G1期监视DNA的完整性。如有损伤，则抑制细胞增殖，直到DNA修复完成。如果DNA不能被修复，则诱导其调亡。2020/1/23164．c-myc–在许多人类恶性肿瘤细胞中都发现有c-myc的过度表达，它能促进细胞增殖、抑制细胞分化。–在凋亡细胞中c-myc也是高表达，作为转录调控因子，一方面它能激活那些细胞增殖的基因，另一方面也激活促进细胞凋亡的基因。–即c-myc给细胞两种选择：增殖或凋亡。当生长因子存在，Bcl-2基因表达时，促进细胞增殖，反之促进细胞凋亡。2020/1/23175.Bcl-2家族–Bcl-2为凋亡抑制基因，存在于线粒体膜、内质网膜以及外核膜上，主要定位于线粒体外膜，能控制线粒体中细胞色素c等凋亡因子的释放，拮抗细胞凋亡。6.Bcr-abl融合基因：–编码一种210000融合蛋白，后者具较高的酪氨酸激酶的活性，能促进CML骨髓细胞的增殖反应，抑制其凋亡。7.ras基因：–编码一种21000的多肽，后者促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。2020/1/2318(二)线粒体与细胞凋亡–细胞应激反应或凋亡信号能引起线粒体细胞色素c释放，作为凋亡诱导因子，细胞色素c能与caspase-9前体、ATP/dATP形成凋亡体（apoptosome)，然后召集并激活caspase-3，进而引发caspases级联反应，导致细胞凋亡。–线粒体既是细胞的能量工厂，也是细胞的凋亡控制中心，线粒体双重功能的发挥，主要原因是各类生长因子都可以促进葡萄糖转运和己糖激酶等向线粒体转运、加速能量生产，相反地剥夺生长因子后，细胞氧消耗降低、ATP合成不足、蛋白质合成受阻，最后细胞走向凋亡。2020/1/2319三、细胞凋亡常用的检测方法Apousefulmensurati(一)、细胞形态学观察法1.光学显微镜–组织切片或细胞涂片经HE或甲基绿-派诺宁染色后，在油镜下观察，Apo细胞体积缩小，胞质浓缩，核染色质密度增高，呈致密浓染的块状或颗粒状。由于光镜不能早期发现Ap细胞核及细胞器的改变，故常不作为单独判断Ap的指标。2020/1/23202.电子显微镜–电镜下观察，Ap细胞染色质固缩，常聚集于核膜下呈境界分明的块状或新月形小体，初期凋亡细胞可见完整的细胞器，细胞膜完整，后期凋亡小体形成。目前一致认为，电镜下获得凋亡细胞特征性的形态学改变是判断细胞Ap的最可靠依据。2020/1/2321电镜下所见细胞凋亡左正常细胞右凋亡细胞2020/1/23223.荧光显微镜–对体外培养的活细胞经荧光色素处理，可在荧光显微镜下观察细胞形态改变。常用荧光色素有①吖啶橙；②Hoechst33258或Hoechst33342；③碘化丙啶(PI)；④溴乙锭(EB)。前两种可分别进入活细胞和死细胞，而后两种荧光素仅能进入死细胞。不同的荧光素使核着染不同颜色的荧光，正常细胞呈均匀荧光染色，而Ap细胞呈致密浓染的颗粒状或块状荧光。荧光镜检查简便易行，但定量定位不如后面提到的流式细胞计数法可靠。2020/1/2323凋亡细胞核被吖啶橙绿染，坏死细胞被碘化丙啶红染。2020/1/2324(二)、反映凋亡细胞膜改变的方法1.染料排斥法–除了电镜能反映细胞膜完整性外，还可用染料排斥法，如溴乙锭(EB)、碘化丙啶(PI)等。坏死细胞膜破损，被染料着染；而Apo细胞膜完整，不被着染，但在体外培养的细胞最终也会发生继发性坏死，因此，此法不能单独用来判断Apo。2020/1/23252.细胞磷酯酰丝氨酸(PS)测定–正常细胞的细胞膜磷脂分布是不对称的，磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）位于细胞膜内侧，在细胞凋亡时转至细胞膜外表面，这一改变被认为是特导性的，并且可作为凋亡细胞表面改变的标记。–PS表面化发生于凋亡早期，其机制尚不清楚，可能是一种导致机体吞噬凋亡细胞的信号。膜联蛋白V是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS具有高度亲和力，荧光标记的膜联蛋白V与细胞表面PS结合，再用荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，可以观察凋亡过程中细胞膜PS的表面化。2020/1/2326(三)、反映DNA有规律断裂的方法1、琼脂糖凝胶电泳法–细胞悬液经裂解消化按常规法提取DNA后，在琼脂糖凝胶中进行电泳，正常细胞DNA呈单一条带；细胞Ap时呈典型的梯状条带，系180～200bp倍数的单/多聚核小体；坏死时呈模糊的弥散状条带。–DNA电泳法是判断Ap的经典方法，但对于一些特殊类型的不发生DNA断裂的细胞Ap，可能缺乏诊断价值。2020/1/23272、流式细胞仪观察法–此法系通过荧光色素如PI、Hoechst等亲DNA的特性，分析细胞DNA含量的直方图来达到判断细胞Ap的目的。Ap细胞经荧光素染色，经流式细胞仪检测，在正常细胞G0G1期的峰前增加一个特异亚二倍体核型峰，即Apo细胞特有的Apo峰。2020/1/2328正常细胞凋亡细胞2020/1/2329四、细胞凋亡与疾病的关系Apoanddisease近年来的研究表明，Apo异常可导致某些疾病的发生，如Apo功能受抑可见于肿瘤、自身免疫病(AID)、病毒感染等；Apo功能增强则见于AIDS、骨质疏松、神经退变性疾病等。2020/1/23301Apo与AID–细胞生理性死亡对于机体清除自身反应性淋巴细胞是十分重要的，Ap受阻在AID发病机制中起重要作用。–研究结果表明，SLE病人血清中存在高水平的可溶性Fas，它能与细胞膜上Fas蛋白(APO-1)竞争性地与Fas配体结合，抑制Fas介导的淋巴细胞的凋亡，导致大量自身抗体的产生。2020/1/23312Apo与肿瘤人类许多肿瘤细胞对某些生理性致Apo因子不敏感。正常机体组织细胞只在特异性生长因子存在的内环境中维持其存活，在非生理环境下则不能存活，而某些肿瘤细胞则能逃避这一环境限制。目前认为，造成这种异常表现的原因从分子机制上考虑有以下几种可能。2020/1/2332①Bcl-2基因异常表达：–Bcl-2是第一个被确认的凋亡抑制基因，是在人囊泡淋巴瘤细胞中染色体易位断点上发现的，最初认为是癌基因。Bcl-2可抑制许多因素引起的Ap，Bcl-2的抑制基因可阻断Bcl-2的作用，诱导肿瘤细胞Ap。②P53基因表达下降：–P53是一种Ap诱导基因，是介导由DNA损伤引起Apo的重要基因。肿瘤细胞P53基因表达不足，使细胞对由DNA损伤诱导的凋亡不敏感。2020/1/23333Apo与病毒感染–AIDS病人HIV感染后，HIV中gp120蛋白与CD4分子结合，被认为是导致CD4＋细胞Apo的重要因素，可能有直接启动Apo基因的作用。此外，HIV感染后的免疫细胞产生细胞因子(如TNF)或表达Fas，也可能导致CD4＋细胞因Apo