细胞破碎-分离纯化

生物分离工程精品课程主讲：曹学君细胞破碎概述第十五章细胞破碎生物分离过程的一般流程原料液细胞分离(离心，过滤)细胞－胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液－胞外产物粗分离(盐析、萃取、超过滤等)纯化(层析、电泳)脱盐(凝胶过滤、超过滤)浓缩(超过滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性细胞破碎概述概述细胞破碎概述一些微生物在代谢过程中将产物分泌到细胞之外的液相中（称胞外酶），这些产品主要为医药和保健产品，如胰岛素、某些细胞因子和疫苗亚单位成分等。这些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培养液中，提取过程只需直接采用过滤和离心进行固－液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步纯化即可。其后续分离和纯化都相对简单。概述细胞破碎概述★但由于一些重组DNA（rDNA）产品结构复杂，必须在细胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细胞分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变，此类rDNA产品是细胞内产品（非分泌型），需要应用细胞破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行提纯，为后续的分离纯化做好准备工作。几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物概述药物名称宿主用途胰岛素大肠杆菌治疗糖尿病人生长激素（HGH）大肠杆菌治疗侏儒病α--干扰素大肠杆菌治疗毛状细胞白血病和卡波济肉瘤细胞破碎概述细胞破碎概述细胞破碎（cellrupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。概述细胞破碎概述微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称原生质体。动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。基于遗传和环境等因素，不同类型生化物质其细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。此外，不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过程中应防止变性和被胞内的酶水解，因此，破碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的。真核细胞概述细胞破碎细胞器概述细胞破碎细胞膜的结构概述细胞破碎细胞破碎细胞壁的组成和结构（细菌肽聚糖结构示意图）概述细胞破碎概述几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖（peptidoglycan）组成，它是难溶性的聚糖链（glycanchain），借助短肽交联而成的网状结构，包围在细胞周围，使细胞具有一定的形状和强度。短肽一般由四或五个氨基酸组成，如L-丙氨酰-D-谷氨酰-L-赖氨酰-D-丙氨酸。而且短肽中常有D-氨基酸与二氨基庚二酸存在。细胞破碎概述虽然几乎所有的细菌都含有肽聚糖的网状结构，但是革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大不同。革兰氏阴性菌比阳性菌复杂，在电子显微镜超薄切片观察，可见革兰氏阳性菌细胞壁较厚，具有20～80nm的肽聚糖层，约占细胞壁成分的40～90％，此外细胞壁还含有大量磷壁酸(eichoicacid)。而革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄，仅2～3nm，占细胞壁成分的10％左右，由于肽聚糖之间仅由四肽侧链直接连接，缺乏五肽桥，故层较疏松，而且肽聚糖居于细胞壁最内层，紧贴在细胞膜上，在肽聚糖层外面还有一较厚的外壁层(约8～10nm)，主要成分为脂蛋白、脂多糖和其它脂类，因此，革兰氏阴性菌细胞壁中脂类含量较高。破碎细菌的主要阻力细胞破碎概述破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。酵母细胞壁的结构示意图细胞破碎概述破碎酵母细胞壁的阻力细胞破碎概述酵母细胞壁的结构示意图如图15－2所示，细胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状，覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白，最外层是甘露聚糖，由1,6一磷酸二酯键共价连接，形成网状结构。在该层的内部，有甘露聚糖-酶的复合物，它可以共价连接到网状结构上，也可以不连接。与细菌细胞壁一样，破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。红面包霉菌(Neurosporacrassa)的细胞壁结构示意图红面包霉菌细胞壁的结构示意图细胞破碎概述细胞破碎概述主要存在三种聚合物，葡聚糖（主要以β-1,3糖苷键连接，某些以β-1,6糖苷键连接），几丁质（以微纤维状态存在）以及糖蛋白。最外层(a)是α-和β-葡聚糖的混合物，第2层(b)是糖蛋白的网状结构，葡聚糖与糖蛋白结合起来，第3层(c)主要是蛋白质，最内层(d)主要是几丁质，几丁质的微纤维嵌入蛋白质结构中。与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。植物细胞壁的化学组成和结构细胞破碎概述对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生壁两部分。初生壁是细胞生长期形成的。次生壁是细胞停止生长后，在初生壁内部形成的结构。概述细胞破碎植物细胞初生壁的化学组成组分结构和分类纤维素β－1，4－D－葡聚糖半纤维素木葡聚糖甘露聚糖木聚糖(包括阿拉伯木聚糖和4-0-甲基-葡萄糖醛酸木聚糖）果胶物质半乳糖醛酸聚糖、鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖蛋白质结构蛋白各种酶类凝集素细胞破碎“经纬”模型细胞破碎概述目前，较流行的初生细胞壁结构是由Lampert等人提出的“经纬”模型，依据这一模型，纤维素的微纤丝以平行于细胞壁平面的方向一层一层敷着在上面，同一层次上的微纤丝平行排列，而不同层次上则排列方向不同，互成一定角度，形成独立的网络，构成了细胞壁的“经”，模型中的“纬”是结构蛋白（富含羟脯氨酸的蛋白），它由细胞质分泌，垂直于细胞壁平面排列，并由异二酪氨酸交联成结构蛋白网，径向的微纤丝网和纬向的结构蛋白网之间又相互交联，构成更复杂的网络系统。半纤维素和果胶等胶体则填充在网络之中，从而使整个细胞壁既具有刚性又具有弹性。细胞破碎概述初生细胞的经纬模型次生细胞壁细胞破碎概述某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚(4μm以上)，常有三层组成。在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质素（酚类组分的聚合物）的沉积。因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。细胞破碎技术细胞破碎细胞破碎技术目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。破碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类。机械法细胞破碎细胞破碎技术机械破碎法又可分为高压匀浆破碎法（homogenization）高速搅拌珠研磨破碎法（finegrinding）超声波破碎法（ultrasonication）非机械法破碎方法细胞破碎细胞破碎技术渗透压冲击破碎法（osmoticshock）冻融破碎法（freezingandthawing）酶溶破碎法（enzymelysis）化学破碎法（chemicaltreatment）去垢剂破碎法（detergents）高压匀浆器（Highpressurehomogenizer）细胞破碎技术阀座撞击环阀杆阀杆压力控制手轮APVMantonGaulin高压匀浆器针型阀结构简图细胞破碎操作原理细胞破碎细胞破碎技术MantonGaulin高压匀浆器是常用的设备，它由可产生高压的正向排代泵（positivedisplacenemtpump）和排出阀（dischargevalve）组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。图15-5为高压匀浆器的排出阀结构简图，细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20℃左右。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。细胞破碎技术高压匀浆器各种阀型设计刀型阀锥型阀球型细胞破碎阀锯齿阀细胞破碎阀标准阀细胞破碎高压匀浆法适用的范围细胞破碎细胞破碎技术高压匀浆法适用的范围：酵母和大多数细菌细胞的破碎。料液细胞浓度可达到20%左右。☆团状和系状菌易造成高压匀浆器的堵塞，不宜使用高压匀浆法。高压匀浆法使用时注意事项细胞破碎细胞破碎技术高压匀浆器的操作温度上升约２－３℃/10MPa为了保护目标产物的生物活性，需要对料液作冷却处理。多组破碎操作中需要在级间设置冷却装置可有效防止温度上升，保护产物活性。高压匀浆器的种类细胞破碎细胞破碎技术高压匀浆器的种类较多WAB公司的AVPGaulin31MR型最大操作压力为24MPa