细胞培养技术

细胞培养技术冯晓桃广西中医药科学实验中心一、细胞培养概念从机体内取出组织或细胞，在体外模拟体内的生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下进行孵育培养，使之生存、生长，并维持其结构和功能的方法。细胞培养特点1、条件可控：研究影响因素2、体外：可用各种手段研究3、长期：遗传性状4、大量提供条件相同的细胞细胞培养目的和作用1、科学研究药物研究与开发新药筛选：如化学合成药物药效研究,中药有效成分筛选与鉴定等。疫苗研究与开发：如病毒性疫苗的研究与开发(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等),肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。基因工程药物研究与开发：如干扰素研究与开发,细胞生长因子研究与开发等。细胞工程药物研究与开发：生物活性多肽研究与开发,人参皂甙,紫杉醇等生物活性成分研究与开发。单克隆抗体制备：包括诊断用单克隆抗体,治疗用单克隆抗体。细胞培养目的和作用基础研究(1)药物作用机理；(2)基因功能；(3)疾病发生机理。2、生物制药疫苗生产：如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等),肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。基因工程药物生产：如在临床医学中具有治疗价值的一些细胞生长因子如干扰素,粒细胞生长因子,胸腺肽等。诊断用和药用单克隆抗体生产。细胞工程药物生产：生物细胞内的一些生物活性多肽,生物活性物质等。二、培养细胞相关条件（一）实验室准备1.无菌操作实验室无菌操作间、缓冲间、更衣室等。2.生物安全柜（超净工作台）生物安全柜是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的。二、培养细胞相关条件生物安全柜分类一级：可保护工作人员和环境而不保护样品，目前已很少用。二级：提供工作人员、环境和产品的保护。A（A1和A2）B（B1和B2）三级：生物安全3、4级实验室用。生物安全柜ESCOAC2-4S1生物安全柜三级生物安全柜3.相关仪器设备（1）CO2培养箱（2）倒置显微镜、普通显微镜及照相系统（3）冰箱（4度，-20度，-80度）（4）超纯水系统（电阻率≥18.2MΩ.cm）（5）细胞存储器（液氮罐，深低温冰箱、-80度冰箱）（6）高温高压灭菌装置、清洗装置（7）滤菌相关仪器（针式滤器，泵加压过滤）（8）离心机、天平、pH仪、移液枪等二、培养细胞相关条件（二）培养用品（1）培养瓶（25、75cm3）培养板（96、48、24、12、6孔）培养皿（各种直径规格）二、培养细胞相关条件（二）培养用品（2）离心管（15、50ml）（3）移液管、吸管（4）冻存管、EP管（5）试剂瓶等。二、培养细胞相关条件（三）细胞培养用试剂（1）培养基MEM，DMEM，RPMI16404℃保存，避免光照；用前放在37℃温热。二、培养细胞相关条件（三）细胞培养用试剂（1）培养基水无机盐氨基酸维生素其他成分——葡萄糖、酚红、HEPES、丙酮酸钠二、培养细胞相关条件（三）细胞培养用试剂（1）培养基培养基选择：按提供细胞来源的要求准备。什么情况下选择无酚红培养基：酚红影响到实验结果流式细胞仪检测细胞样品二、培养细胞相关条件（三）细胞培养用试剂（2）血清二、培养细胞相关条件血清分类1、特级胎牛血清（最高级别的）（1）Hyclone北美特级胎牛血清（SH30070.03）（2）Gibco北美特级胎牛血清（16000-044）2、优等级胎牛血清（1）Hyclone加拿大优等胎牛血清（SH30396）（2）Hyclone澳大利亚优等胎牛血清（SH30084）（3）Gibco澳大利亚胎牛血清（10099-141）二、培养细胞相关条件血清分类3、普通进口胎牛血清如Hyclone南美胎牛血清（SV30087）4、国产的各种系列胎牛血清国产的胎牛血清，国内没有严格意义的胎牛血清，胎牛血清本身是需要穿刺取血的，而国内都是剖腹产出胎牛，8小时左右取血，然后，进行过滤分装。5、其他血清新生牛血清，小牛血清，一般国产的。二、培养细胞相关条件（三）细胞培养用试剂（2）血清使用：5～20%。保存：–20～-70℃储存；4℃存放勿超过一个月。解冻步骤：-20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装或使用。二、培养细胞相关条件（三）细胞培养用试剂血清解冻后发现有絮状物出现，该如何处理?原因：脂蛋白的变性；血纤维蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解冻后，也会存在于血清中，也是造成絮状物的主要原因之一。这些絮状物的产生不会影响血清本身的质量。去除方法：可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，将上清液加入培养基内一起过滤。我们不建议您直接过滤血清以去除这些絮状物，因为它可能会阻塞过滤膜。二、培养细胞相关条件（三）细胞培养用试剂血清热灭活：56℃,30分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。目的：使血清中补体成份失活。启动的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，启动淋巴细胞和巨噬细胞活化。在免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。除非必须，一般不建议作此热处理。二、培养细胞相关条件（二）细胞培养用试剂（3）缓冲液Hanks、PBS4℃保存，避免光照；用前放在37℃温热。二、培养细胞相关条件（4）抗生素工作浓度储存温度杀灭细菌penicillin100units/ml-20℃G(+)bacteriastreptomycin100ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteriachlotetracycline50ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteriagentamicin50ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteria,mycoplasmaamphotericinB2.5ug/ml-20℃yeastandmoldsnystatin50ug/ml-20℃yeastandmoldsfungizone2.5ug/ml-20℃yeastandmolds二、培养细胞相关条件（5）添加因子生长因子（EGF、FGF、BFGF）、胰岛素、肝素、二巯基乙醇等（6）消化液胰酶（0.25%、0.125%）、EDTA（0.02%）消化效果与浓度、温度、时间、pH值等相关二、培养细胞相关条件（三）细胞培养用试剂（7）其他谷氨酰胺：终浓度2mmol/LHEPES：10-25mmol/L丙酮酸钠：终浓度1mmol/L2-巯基乙醇：终浓度50uM1.细胞培养介绍.flv二、培养细胞相关条件（一）基本操作1.无菌操作防止微生物污染；培养用一切物品、液体都无菌。（37度预热，或室温平衡）2.操作区消毒75%酒精擦拭（生物安全柜，进入操作区物品）紫外消毒20-30min3.洗手和着装4.实验操作动作稳、准，幅度小；物品摆放合理，工作有序，缩短暴露时间。2.灭菌消毒.flv三、培养细胞技术（二）细胞来源1.原代培养从机体上取下细胞、组织或器官，让它们在体外维持与生长。（实际中，传10代以内的细胞用作原代培养细胞）特点：表现来源组织或细胞特征。三、培养细胞技术（二）细胞来源（1）组织块培养法从机体上取下组织，使其在体外维持与生长，细胞从组织块边缘向外长出，铺满培养瓶（皿），即可进行传代。特点：表现来源组织或细胞特征。三、培养细胞技术（二）细胞来源（1）组织块培养法基本过程：无菌条件下，取组织，去掉组织表面血污剪成小块（0.5～1mm3）反复漂洗（Hanks液和完全培养液）接种于培养皿，培养箱培养长满后传代三、培养细胞技术（二）细胞来源（2）消化培养法与组织块培养法区别：A.用酶制剂处理组织块，除去细胞间质，使细胞分离，形成细胞悬液；B.细胞生长方式多为单层。优点：更易摄取营养、排除代谢产物生长较快。缺点：操作繁杂，易污染；消化可能对细胞有损伤。三、培养细胞技术（二）细胞来源2.细胞系（cellline）原代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（FiniteCellLine）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（InfiniteCellLine）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。三、培养细胞技术原代培养细胞的生命归宿原代培养期传代期衰退期（二）细胞来源3.细胞株（cellstrain）从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（substrain）。细胞库：美国菌种保藏中心（ATCC）中国典型培养物保藏中心上海细胞库各科研机构三、培养细胞技术培养细胞的特性培养细胞的生长方式贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。大多数细胞属此型。失去在体内特有形态。–成纤维细胞型、上皮细胞型、游走型、多形型。悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。每代贴附生长细胞的生长过程游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一4小时贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）潜伏期此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。机制：接触抑制、密度依赖性（三）细胞培养常规操作技术1.细胞传代培养细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。三、培养细胞技术贴壁细胞传代操作流程：（1）弃去培养液。（2）加入胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。（3）消化时间约为1～3分钟。倒置镜下观察细胞。原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，细胞间出现空隙，细胞未漂起时弃去胰酶，同时用Hanks或培养液终止消化。（4）制作细胞悬液，细胞计数（有经验者可省），根据细胞数目和细胞生长特点，按1:2～1:6进行传代，置37℃下继续培养。三、培养细胞技术附：消化液配制方法：称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s液（D-Hank’s）溶解，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。可配成1%溶液，-20℃保存，用前稀释成0.25%。胰酶溶液中也可加入EDTA，使最终浓度达0.02％。3.细胞传代.flv三、培养细胞技术2.细胞冻存在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。三、培养细胞技术三、培养细胞技术细胞冻存操作（1）收集对数生长期细胞，细胞定量。（2）加入保护液（10%DMSO），调整至4～10×106/ml左右。（3）将悬液分至冻存管中，每管1ml。（4）将冻存管口封严。（5）贴上标签，写明细胞名称、代数、冻存日期等。（6）标准降温速度：-1～-2℃/min；温度达到