链霉素发酵提取工艺

链霉素的发酵工艺链霉素结构的图片1、概述链霉素（streptomycin）是一种氨基葡萄糖型抗生素，分子式C21H39N7O12。1943年美国S.A.瓦克斯曼从链霉菌中分离得到，是继青霉素后第二个生产并用于临床的抗生素。它的抗结核杆菌的特效作用，开创了结核病治疗的新纪元。从此，结核杆菌肆虐人类生命几千年的历史得以有了遏制的希望。5-(2,4-diguanidino-3,5,6-trihydroxy-cyclohexoxy)-4-[4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-methylamino-tetrahydropyran-2-yl]oxy-3-hydroxy-2-methyl-tetrahydrofuran-3-carbaldehyde双氢链霉素硫酸链霉素链霉素性状：白色或类白色粉末，无臭或微臭。溶解情况：易溶于水，微溶于乙醇，不溶于甲醇、氯仿和丙酮。作用范围：硫酸链霉素为一种氨基糖苷类抗生素。链霉素对结核分枝杆菌有强大抗菌作用，其最低抑菌浓度一般为0.5mg/ml。非结核分枝杆菌对该品大多耐药。链霉素对许多革兰阴性杆菌如大肠埃希菌、肠杆菌属、沙门菌属等也具抗菌作用；脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌亦对该品敏感。链霉素对葡萄球菌属及其他革兰阳性球菌的作用差。各组链球菌、铜绿假单胞菌和厌氧菌对该品耐药。链霉素主要与细菌核糖体30S亚单位结合，抑制细菌蛋白质的合成。细菌与链霉素接触后极易产生耐药性。链霉素和其他抗菌药物或抗结核药物联合应用可减少或延缓耐药性的产生也用于结核病的二线治疗，多与其它抗结核药合用。链霉素研究现状链霉素(Streptomycin)是1944年发现的第一个氨基糖贰类抗生素，也是继青霉素后的第二个重要抗生素一般认为链霉素是治疗结核杆菌感染的首选药物，除此以外，还用于治疗革兰氏阴性菌所引起的泌尿道感染、结核性脑膜炎、鼠疫、肠道感染、肺炎、败血症、百日咳等。链霉素的缺点是容易产生耐药性，长期使用对第八对脑神经有毒害。除了医用外，也有报道将链霉素用于农牧业的。例我国新疆某生产建设兵团的农场自1985年起应用链霉素治疗菜类、瓜类和粮食等作物的病害，取得较好效果;链霉素还可用于猪肺炎、雏鸡白痢疾、以及鸡、鸭、鹅的巴氏杆菌感染等的治疗。国内有些厂家将生产的链霉素作为农用出口，效益较好。1.生产菌种2.工艺流程3.链霉素的发酵条件及中间控制31、生产菌种早期发现产链霉素的生产菌种是灰色链霉菌。后来又找到了产链霉素的其他类型链霉素族抗生素(如羟基链霉素或双氢链霉素)的菌种。如比基尼链霉菌、灰肉链霉菌等。灰色链霉菌的孢子柄直而短，不呈螺旋形。孢子量很多，呈椭圆球形。气生菌丝和孢子都呈白色。单菌落生长丰满，呈梅花形或馒头形，直径约为3～4mm。基内菌丝透明，在斜面背后产生淡棕色色素。链霉素产生菌诱变育种常用的诱变剂有：紫外线、γ射线、氮芥、乙烯亚胺、亚硝酸和硫酸二乙酯等。一些化学诱变剂又经常和紫外线等进行复合处理。近年来采用亚硝基胍、快中子和激光等，诱变选育出营养缺陷型或再回复突变型高产菌株。杂交育种与诱变育种相结合的方法，对提高菌种的生产能力，收到了较好的效果。实验室涂片结果灰色链霉菌生长状态液氮保藏(-196℃)沙土管保藏(2-4℃)原斜面孢子中罐种子小罐种子摇瓶种子斜面孢子(代1)大罐发酵液提炼车间斜面培养恒温恒湿35-36℃，7天斜面培养恒温恒湿34-35℃，6天摇瓶培养33-34℃，39.5h转速250rpm装量80ml/750ml接种量一块斜面/瓶50-64h小罐种子培养36±0.5℃，24-30h转速60-300rpm，搅拌功率5.5kw通气量2m3/min,罐压0.03Mpa中罐种子培养36±0.5℃，25h转速60-240rpm接种量15%通气量1.5VVM罐压0.03Mpa搅拌功率22kw大罐发酵36±0.5℃，136h转速60-130rpm接种量15%通气量0.75VVM罐压0.04Mpa搅拌功率115kw2.工艺流程或培养方式斜面孢子培养摇瓶种子培养种子罐扩大培养发酵培养(一)斜面孢子培养将砂土管(或冷冻管)菌种接种到斜面培养基上，经培养后即得原始斜面。斜面培养基的主要成分有葡萄糖、蛋白胨和豌豆浸汁等，其中蛋白胨和豌豆浸汁的质量对斜面孢子质量影响很大。蛋白胨是最关键的原材料，对产孢子数量的影响不容忽视。豌豆的品种和产地以及培养基的pH值(以中性或偏酸性为宜)对产孢子质量亦有影响，需特别注意。(二)摇瓶种子培养生产斜面的菌落接种到摇瓶培养基中，经过培养即得摇瓶种子。链霉素发酵经常使用：瓶种子来接种种子罐。种子质量以菌丝阶段、发酵单位、菌丝黏度或浓度、糖氮代谢、种子液色泽和无杂菌检查为指标。摇瓶种子(母瓶)可以直接接种子罐，也可以再扩大培养，用培养所得的子瓶接种。摇瓶种子检查合格后，贮存于冷藏库内备用，冷藏时间最多不超过7天。(三)种子罐扩大培养种子罐培养是用来扩大种子量的。种子罐培养为1—3级，可根据发酵罐的体积大小和接种量来确定。第一级种子罐一般采用摇瓶种子接种，2—3级种子罐则是逐级转移，接种量一般都为10％左右。种子质量对后期发酵的影响甚大，因此种子必须符合各项质量要求。故在培养过程中，必须严格控制好罐温、通气搅拌和泡沫控制，以保证菌丝生长良好，得到合格的种子。(四)发酵培养链霉素的发酵培养基主要由葡萄糖、黄豆饼粉、硫酸铵、玉米浆、磷酸盐和碳酸钙等所组成。(1)碳源及其代谢葡萄糖是链霉素发酵的一种较好的碳源，用其他碳源(如淀粉、糊精、麦芽糖等)发酵单位都比葡萄糖低。葡萄糖的用量，视补料量的多少而定，总量一般在10%以上，以保证在发酵过程中有足够的碳源.(2)氮源有机氮源包括黄豆饼粉、玉米浆、蚕蛹粉、酵母粉和麸质水，其中以黄豆饼粉为最佳。无机氮源以硫酸铵和尿素为最常用，氨水可作无机氮源使用，又可调节发酵pH。采用黄豆饼粉浸液(pH6.0，38—40℃处理2h)作为氮源，其发酵单位高峰出现比未处理者为早，这说明可溶性氮比不溶性氮易于利用，对缩短周期有好处。(3)其他无机离子在复合培养基中已经存在，一般就不需再添加。为了调节pH，中和代谢过程中所产生的有机酸，尚需加人CaCO3。Co+是一种酶的激活剂，又是生物合成维生素B12的前体，通常需加入极微量，K+有促进生长的作用，Na+与维持细胞渗透压有关，通常加入0.25％左右量的NaCl即可，增加用量会明显影响菌的生长繁殖。Mn2+、Mg2+对链霉菌菌丝生长有明显作用。Fe2+浓度超过60ug／mg以上，就要产生毒性，显著影响链霉素的产量，而对菌丝体生长影响较小，一般适用量在20ug／ul左右。3．链霉素的发酵条件及中间控制(1)通气和搅拌：灰色链霉菌是一种高度需氧菌。在黄豆饼粉培养基内增加通气量能提高发酵单位，又能使pH升高。(2)温度：灰色链霉菌对温度敏感。一般认为链霉素发酵温度以28．5℃左右为宜。（4)中间补料控制：为了延长发酵周期，提高产量，链霉素发酵采用中间补碳、氮源，通常补加葡萄糖、硫酸铵和氮水，这样还能调节发酵的pH。根据耗糖速率，确定补糖次数和．补糖量。(3)pH：适合链霉菌菌丝生长的pH6.5—7.0，适合于链霉素合成的pH为6.8—7.3，pH低于6.0或高于7.5，对链霉素的生物合成都不利。链霉素的提取和精制1.发酵液的过滤及预处理2.吸附与解吸附3.精制链霉素的提取和精制过程发酵液粉针剂饱和树脂原液水针剂成品浓缩液精制液洗脱液过滤洗脱吸附脱色中和精制脱色浓缩1．发酵液的过滤及预处理发酵终了时，所产生的链霉素，有一部分是与菌丝体相结合的。用酸、碱或盐作短时间处理以后，与菌丝体相结合的大部分链霉素就能释放出来。工业上，常采用草酸或磷酸等酸化剂处理，以草酸效果较好，可用草酸将发酵液酸化至pH＝3左右，直接蒸汽加热(70－75℃)，维持2min(这样能使蛋白质凝固，提高过滤速度)，迅速冷却、过滤或离心分离。过滤后，所得酸性滤液也可进行碱性处理，进一步除去蛋白质，或者直接用NaOH凋pH值至6.7—7.2。原滤液的质量标准一般是：①外观澄明；②pH＝6.7—7.2；③温度在10℃以下；④高价离子含量很少；⑤链霉素浓度为5000U／ml左右。根据链霉素的稳定性、解离度和树脂的离解度，选择原滤液pH值为中性附近，即pH＝7左右，既可保证链霉素不受破坏，又能使链霉素和钠型羧基树脂全部解离，有利于离子交换。为防止链霉素破坏，温度应适当降低，维持在10℃左右,原液中高价离子(Ca2+，Mg2+)对离子交换吸附影响很大，因此必须在发酵液预处理时将这些离子除掉。草酸能将Ca2+去除掉。一些配合剂如三聚磷酸钠(Na5P3O10)，能和Mg2+形成络合物，减少树脂对Mg2+的吸附。2.吸附与解吸附链霉素在中性溶液中呈三价的阳离子，可以用阳离子交换树脂吸附。试验表明，磺酸型树脂虽能吸附链霉素，但二者的亲和力太强，不易用酸洗脱下来。羧酸型树脂吸附链霉素后，很容易洗脱。因此，目前生产上都用羧酸树脂的钠型来提取链霉素。其交换吸附和洗脱的反应可用下列方程式表示：3.精制高交联度树脂精制高交联度的氢型磺酸树脂的结构紧密，金属小离子可以自由地扩散到孔隙度很小的树脂内部与阳离子交换，而有机大离子就难于扩散到树脂内部进行交换。经过高交链度树脂交换后，交换液变酸，需经弱碱羟型树脂中和，就得精制液。其反应方程式如下。国外链霉素产品相关公司国外生产链霉素的有近二十个国家的约三十家制药公司。其中主要的公司有美国的默克(Merck)公司、辉瑞(Pfizer)公司、施贵宝(Squibb)公司，英国的格兰素(Glaso)公司、比彻姆(Beecham)公司，德国的赫斯(Hoechst)公司，法国的罗纳·普朗克(RhonePoulenc)公司，丹麦的挪佛(Novo)公司，日本的协和(Kyowa)发酵株式会社等等。此外还有原苏联、荷兰、印度、保加利亚、西班牙等国家的一些公司。国内链霉素相关情况链霉素是我国较早投入生产的抗生素之一。生产企业曾有十几家，包括杭州药厂、扬州制药厂等。近几年仅剩华北制药厂等五家药厂生产。近十年来，我国链霉素的年产量一直维持在1000吨以上，国内产量最大的是华北制药厂，年产量在650吨左右，其次是大连制药厂和山东济宁坑生素厂，年产量均在200-250吨左右。链霉素产品存在的问题由于链霉素的耳毒性较严重，世界各国的产量和使用量呈逐年下降趋势。如原苏联1976年链霉素的产量达1415吨，1987年降为600吨，1989年为800吨左右。美国施贵宝公司和匈牙利的诺因工厂先后于1977年和1980年停产。目前国外链霉素的主要生产企业是美国的辉瑞公司和法国的罗纳·普朗克公司。目前全世界链霉素产量估计在2500吨至3000吨左右。产品质量目前国内所有链霉素生产企业都能达到出口标准，一般认为华北制药与上海第四制药厂的质量相对较好。链霉素质量方面的共性间题是:成品色级达不到新优级品标准，异常毒性偏高，生物效价偏低，澄明度不符合标准等。国内外技术水平比较我国链霉素生产量居世界前列。生产技术指标中，发酵水平与英、美公司比略显落后(英国葛兰素公司发酵单位30000-40000a/ml,但发酵周期比我国长1倍);提炼效率高于葛兰素公司，我国处于领先水平。谢谢！