药物代谢

药物代谢大纲药物代谢反应简介影响药物代谢的因素代谢稳定性代谢产物的鉴定代谢途径鉴定CYP450的抑制及诱导肝清除率的预测药物代谢反应简介Introductionofdrugmetabolismreaction药物代谢反应的分类•一相代谢•二相代谢一相代谢反应•氧化反应（CYP450催化）–芳香族羟化（Aromatichydroxylation）–脂肪族羟化（Aliphatichydroxylation）–环氧化（Epoxdation）–脱烷基（Dealkylation）–氧化脱氨基（Oxidativedeamination）–氮氧化（N-Oxidative）–硫氧化（S-Oxidative）–脱卤素（Dehalogenation）•氧化反应（非CYP450催化）–醇脱氢（Alcoholdehydrogenase）–醛氧化（Aldehydeoxidatiion）–黄嘌呤氧化（Xanthineoxidase）–胺氧化（Amineoxidase）–芳香化（Aromatase）•还原反应–偶氮化合物，硝基化合物–环氧化合物–杂环化合物，卤代烃•水解反应–酯水解–氨基化合物水解–酰胺水解•其他一相代谢反应–水合•一相反应概述–大部分情况下代谢产物含有具有化学反应性的官能团，例如：-OH，-NH2，-SH，-COOH等–为进一步的二相代谢做准备二相代谢反应•与糖结合–同葡萄糖醛酸结合•同酚，醇及羧酸结合（O-Glucuronides）•同胺，酰胺及磺胺结合（N-Glucuronides）–同其他糖类结合•葡萄糖（主要在昆虫中）•木糖•核糖•磺酸化–主要底物为酚类–辅助因子为PAPS•甲基化–主要底物为内源性物质–辅助因子为SAM•乙酰化–主要底物为芳香胺，磺胺–辅助因子为乙酰辅酶A•同氨基酸结合•同谷胱甘肽结合•同脂肪酸结合•二相反应概述–需要富能/活化中间体（辅因子/活化的药物）–产物水溶性大–一般为药物的解毒步骤影响药物代谢的因素Factorsaffectdrugmetabolism•药物代谢受许多因素的影响–内因（种属，基因，年龄，性别，激素及疾病）–外因（饮食，环境，合并用药）影响代谢的内部因素•种属–不同种属中的代谢速度不同–不同种属中的代谢途径不同•基因–不同品系动物间的差异–CYP2D6的多态性•快代谢及慢代谢型的代谢速率有差异•不同人群中的分布比例具有差异•年龄–新生及幼年阶段代谢酶发育不完全–老年阶段代谢酶活性下降–一相代谢情况复杂–二相代谢酶一般在胚胎期缺失或者活性低，出生后活性逐渐加强，在生命早期达到成年水平，并在老年阶段变化不大。•激素水平/性别•疾病状态–肝脏疾病•肝硬化，病毒性肝炎，肝癌：代谢能力下降•酒精肝：代谢能力上升–非肝脏疾病•激素相关疾病：甲亢，糖尿病等影响代谢的外部因素•营养物质–蛋白质•摄入不足导致一相代谢能力下降•二相代谢能力变化复杂–脂肪•摄入不足导致代谢能力下降•补充不饱和脂肪酸能提高代谢能力•高脂饮食对不同组织的影响不同–碳水化合物•对代谢影响不大–饥饿•导致部分酶活性上升，部分下降–总体来说上述物质对代谢能力有很大的影响，但结果预测很难•非营养物质•环境因素–重金属（铅）•大鼠慢性暴露：对代谢能力影响不大•大鼠急性暴露：代谢能力下降–环境污染物（多氯联苯）•诱导代谢能力–杀虫剂（灭蚊灵，开蓬）代谢稳定性Metabolicstability概述•代谢稳定性–在具有代谢活性的实验体系中原型药随时间所减少的百分比•实验体系–肝微粒体，S9，肝细胞•检测方法–HPLC,LC/MSMS实验体系•肝微粒体–不含胞浆酶，eg单胺氧化酶，谷胱甘肽转移酶–需要辅助因子，egNADPH，UDPGA–多用于高通量筛选•肝细胞–原代肝细胞，冻存肝细胞–包含所有酶活性，无需添加辅助因子–多用于定性研究•S9–包含了微粒体酶及胞浆酶–但不具备细胞结构S9/微粒体的制备•S9的制备流程–缓冲液：1.15%KClin0.05MTris-HCl(pH7.4)–断头处理动物，取肝脏–加入缓冲液（4倍湿重），制备肝匀浆–9,000g离心30min，取上清•肝微粒体的制备流程–S9105,000g离心1小时–弃去上清液–沉淀用0.1M蔗糖在悬浮微粒体/S9孵育体系体系组成终浓度缓冲液系统PBS,Tris(pH=7.4)微粒体0.1-1mg/mL辅助因子NADPH/UDPGA底物37ºC条件下孵育肝细胞培养体系体系组成终浓度培养液CedraCompleteMedia肝细胞1-2*106cell/mL辅助因子N/A底物37ºC，相对湿度95%，CO25%条件下孵育•同时进行对照组的孵育–不含药物（空白对照）–不含S9/微粒体/肝细胞（考察化学稳定性）–含代谢过程已知的药物（考察酶活性）样品检测•样品前处理–孵育/培养结束后加入含内标的终止液，离心，取上清进样分析•样品分析–原型药（主要关注点）–代谢物示例参数的计算•T1/2–底物浓度固定，测定不同时间点原型药的浓度–对数化后回归求得•CLint–不同底物浓度，测定同一时间点代谢产物的浓度–CLint=Vmax/Km注意事项•系统中有机溶剂的浓度–避免使用有机溶剂–甲醇乙腈2%;DMSO0.4%•NADPH生成系统/待测药物的稳定性–现配现用•缓冲液的pH值–保存后需再次测定pH•确保肝微粒体均一–加入前充分涡旋代谢产物鉴定Metaboliteprofiling实验流程•样品孵育–S9，肝微粒体•样品处理–SPE，PP,LLE•代谢产物的测定/鉴定–HPLC,LC/MSMS,NMRS9孵育体系组成组成终浓度Tris-HCl50mMMgCl25mMGlucose-6-phosphate5mMNADP0.5mMS94mg/mL•孵育体系的总体积一般为5mL•加入少量（5-50uL）药物溶液启动反应•药物的终浓度在1-10ug/mL或1-10uM•在各时间点取出部分样品，加入等量冰乙腈终止反应。•该体系主要产生一相代谢产物微粒体孵育体系组成组成终浓度Tris-HCl50mMMgCl25mMGlucose-6-phosphate5mMNADPH/UDPGA0.5mM肝微粒体4mg/mL•辅助因子为NADPH–主要生成一相代谢产物•辅助因子为UDPGA–长时间孵育可生产葡萄糖醛酸结合产物代谢产物鉴定的样品处理•直接沉淀蛋白•有机溶剂萃取–乙酸乙酯，二氯甲烷•固相萃取代谢产物的鉴定•HPLC法推定结构–梯度洗脱–检测原型药及代谢产物–收集流份–MS/HMR结构鉴定–放射性标记后可进行对原型药及代谢产物进行初步的定量分析•LC/MSMS法推定结构–检测总离子流图–MSn鉴定结构–TOF鉴定结构注意事项•混合人肝微粒酶活性有较大差异•除缓冲液外的其他组成应现配现用•雄性大鼠S9/微粒体中CYP450的活性大于雌性大鼠•对于每批S9/肝微粒体应有对照药物组来证明其活性•根据药物溶解性选择溶剂–缓冲液甲醇DMSO•通过加入有机溶剂，并保存在-20ºC条件下来迅速中止反应•许多情况下S9优于微粒体–便于制备，总活性较强–无需添加NADPH–能够生成乙酰化代谢产物代谢途径鉴定Metabolicpathwayidentification概述•了解药物代谢途径的重要意义–尤其对于通过单一酶进行代谢消除的药物–影响药物的安全性和有效性–指导个体化的给药剂量–避免合并用药时可能发生的不良反应•超过60%的药物的代谢是由CYP450催化的一相氧化反应•葡萄糖醛酸化反应是最主要的二相反应CYP450代谢途径鉴定•CYP450简介–主要存在于肝脏的微粒体中,故也称为肝微粒体酶（也有肝外分布）–因其还原型与一氧化碳的复合物（P450-CO）在450nm处有一强吸收峰,故而得名细胞色素P450•在人体中至少有53个分属于18个家族的CYP450基因•其中CYP1，CYP2及CYP3家族为主要参与外源性物质代谢肝中各主要亚型的比例•CYP450酶的特点–几乎能够代谢所有结构的药物–同一药物能够被多个亚型所代谢–与一般酶相比，反应速率较慢鉴定代谢途径的方法•抑制剂法（化学抑制剂/抗体）•纯酶法（重组酶）•相关回归法•抑制剂法实验流程–酶动力学试验–加入特异性抑制剂进行共孵育–考察有无抑制剂存在时反应活性的差异CYP450各主要亚型的抑制剂其中2C19及2E1的抑制剂特异性不强，推荐使用抗体•注意事项–酶动力学试验中确保底物消耗小于10%–底物浓度的选择（Km附近）–抑制剂的选择（高特异性）–抑制剂的浓度（有效前提下尽量低）研究示例19份HLM中2C9抗体对X药代谢活性的影响•纯酶法实验流程–获得商业化供应的各亚型的纯酶–各亚型的纯酶重进行孵育–观察不同亚型的纯酶中底物的剩余率•所得的Km需要同HLM中的Km进行比较–rCYPHLM：体内可能无贡献–rCYPHLM：低浓度时的主要代谢亚型•回归分析法实验流程–进行待测药物的孵育–进行探针药物的孵育–将同一份孵育体系中探针药物与待测药物的反应速率进行回归•也可以将药物代谢产物生成速率同特定CYP450亚型在肝脏中的含量/mRNA水平等进行回归•基本原理是基于不同CYP450亚型在个体间表达的差异研究示例注意事项•必须了解酶动力学过程–单一酶催化：底物浓度应该能够达到Vmax–多个酶催化：底物浓度接近生理浓度•肝微粒体的筛选–去除对于各亚型探药有相关性的肝微粒体–所有用于相关性回归的肝微粒体中各亚型探药的R20.3•用于回归分析的肝微粒体数量–至少10个，最好20个•相关系数良好，但在Y轴有较大的正截距说明有其他酶参与代谢CYP1A2及2D6均能催化该反应，对该反应的活性同CYP1A2探药反应活性进行回归分析。UGT代谢途径鉴定•UGT简介–是体内最主要的二相代谢酶–主要功能包括：•结合一些内源性物质（胆红素，固醇类物质）•结合一些药物及其一相代谢产物人肝中UGTs各亚型代谢药物的比•在人肝中UGT1A1、1A4、1A6、1A9和2B7为最主要的UGT亚型•上述五种亚型催化了90%以上药物的葡萄糖醛酸化代谢鉴定代谢途径的方法孵育体系组成终浓度Tris/PBS50-100mMUDPGA5mMMgCl25mM微粒体/重组酶0.5-1mg/mL水解酶抑制剂可选孵育条件的优化•孵育过程中底物消耗不得超过10%•在确保反应呈线性的条件下（时间，蛋白浓度），取最低的底物浓度•体外孵育条件下UGTs的稳定性强于CYP450•避免使用较高的蛋白浓度•采用Saccharolactone(2–10mM)抑制水解反应•采用Alamethicin增加底物接触酶活性位点的几率•维持pH在生理范围（7.0-7.5）•确保UDPGA，MgCl2处于饱和状态•代谢产物的确认–水解酶孵育后测定–碱水解（acyl-glucuronides）–酸水解（N-glucuronides）重组酶法鉴定代谢途径•rUGTs活性筛选–对所有亚型进行孵育–使用2个底物浓度（Km及10*Km）–当有超过1个亚型表现出活性时需要结合其在肝脏中的相对丰度来判断哪个是主要亚型–mRNA：2B41A31A42B151A62B72B171A91A1•酶动力学比较分析–参加比较的亚型：具有最强活性-10%最强活性–rUGTHLM(亲和力低)：体内无贡献–rUGTHLM(亲和力高)：低浓度时的主要代谢亚型（临床相关）回归法鉴定代谢途径•不同HLM中各UGT亚型表达有差异•将待测药物与探针药物的反应活性进行回归分析•具有最高相关性的亚型即为代谢该药物的主要亚型•底物浓度设在混合肝微粒体中的Km值附近•孵育条件下下表抑制剂法鉴定代谢途径•化学抑制剂法–到目前为止关于其制剂作用的特异性均未经过系统的评价–需要在HLM及rUGT中同时进行试验•特异性的抑制作用–在HLM及单个rUGT中的抑制作用相等•非特异性的抑制作用–有多个rUGT中的抑制作用相同，或者其它rUGT亚型表现出比应该出现抑制作用的亚型的抑制作用还要强•免疫抑制法–理论上可行–目前没有商业化的抗体供应CYP450的抑制及诱导Inhibitio